实验诊断实验课课件

实验一白细胞计数•一目的：熟悉白细胞计数方法，掌握白细胞计数参考值及临床意义。•二原理：用2%稀醋酸(冰乙酸)作白细胞计数稀释液，可使红细胞溶解，留下白细胞，用血细胞计数板计数一定体积中的白细胞数，计算出每升血液中白细胞的总数。•三器材：白细胞稀释液、显微镜、计数板、采血针、小玻棒、小试管、试管架、微量吸管、小纱布、75％酒精棉球、消毒干棉球•四步骤：1.以2％冰乙酸溶液为白细胞计数稀释液，用吸管准确吸取稀释液0.38ml，置于清洁干燥的小试管中。•2.毛细血管采血法:用微量吸管采血至20微升处，擦去管尖外围多余的血液，将管内血液迅速注入试管底部，并用上清液将管内残存血液洗净，立即混匀。待液体呈褐色后，再振荡均匀，用小玻棒取此液注入计数池内，静置2－3分钟。•3.用低倍镜计数四角的四个大方格内的白细胞数(N)。•压线细胞计数原则：数上不数下，数左不数右。五计算：•四个大方格内白细胞数（N）(N)/4×10×20×106＝白细胞数/升•式中：四个大方格内白细胞总数/4，算出•每个大方格（即0.1微升）内白细胞平均数。•×10把0.1微升换算为1微升。•×20为血液稀释倍数。•×106将1微升换算为1L。六参考值：成人（4～10）×109/L•6个月至2岁婴儿（11～12）×109/L•新生儿（15～20）×109/L八注意事项：•1．稀释倍数一定要准确（包括采血量和加稀释液量）。•2．小试管、计数板一定要清洁，以免杂质、微粒等被误认为细胞。•3.一定要待稀释液转化为棕褐色后方可进行计数，此时红细胞已完全破坏，否则可因红细胞残留而干扰计数，使结果偏高。九思考题：白细胞总数增多的临床意义？•实验二红细胞计数•一实验目的：掌握红细胞计数原理和方法，熟悉红细胞参考值及临床意义。二实验原理：用红细胞稀释液将血液稀释一定倍数，置于血细胞计数板内，于显微镜下计数一定体积内的红细胞数，然后再计算出每升血液内的红细胞数。三实验器材和试剂：红细胞稀释液（0.85%NaCl）、显微镜、小试管、细胞计数板、盖玻片、微量吸管、试管架、采血针、小玻棒、75%酒精棉球、小纱布、消毒干棉球、报告单。四实验步骤：1.取试管1支，加红细胞稀释1.99ml。2.消毒皮肤，用采血针刺破皮肤，使血液自动流出，拭去第一滴血，用一次性微量吸管准确取血10微升。3.去管尖外部余血，轻轻注入红细胞稀释液底部，再吸取上层稀释液清洗吸管2-3次，立即摇匀。4.倾斜试管用小玻棒沾取红细胞悬液，注入血细胞计池内，要求一次充好，不要产生气泡。静置2-3分钟，使红细胞完全沉降。5.将计数板置于显微镜下用高倍镜计数中央大方格红细胞计数区四个角和中间的一个中方格共5个中方格内的红细胞。凡压在中方格边缘上的红细胞，以数上不数下，数左不数右的原则进行计数。•五计算•R（五个中方格内RBC数）R×5×10×106×200=△.△△×1012个/升•式中：•×5：5个中方格内红细胞数换算为1个大方•格内红细胞数•×10：1个大方格容积（0.1微升）换算成1微升•×106：1微升换算为1升•×200：血液稀释倍数•六实验报告方式：△.△△×1012/L•七正常参考值：成年男性：4.00-5.50×1012/L•成年女性：3.50-5.00×1012/L•新生儿：6.00-7.00×1012/L八注意事项：1.显微镜物镜接近计数板时应注意，勿损坏计数板及镜头。2.计数时进入显微镜的光线要适中，否则不易找到方格。计数池内的细胞分布要均匀，各中方格的细胞相差不应超过±10%，否则重新计数。3.试管、计数板须清洁，以免杂质、微粒等被误认为红细胞。4.稀释倍数要准确。5.计数完毕后，用清水将计数盘和盖玻片冲洗干净，待干后备用。九思考题：1.计数不准确的常见原因有哪些？2.红细胞数增多减少的临床意义？实验三白细胞分类计数一实验目的：掌握白细胞分类计数原理和方法，熟悉白细胞分类计数的参考值及临床意义。二实验原理：白细胞的胞质、胞核和胞桨颗粒等含有不同的化学成分，其与各种染料的亲和力不同。经染色后能着上不同的颜色，根据颜色的差异，可将白细胞区别并进行分类计数。三实验器材和试剂：显微镜擦镜纸75％酒精推玻片吸水纸消毒干棉球载玻片染色架瑞氏染色液采血针香柏油缓冲液吸球二甲苯四实验步骤：1.血涂片制备--取末梢血一滴，置于载玻片一端，将推片的一端，放在血滴前面，逐渐后移接触血滴，血滴好沿推片散开，然后使推片与载玻片间成30°～45°夹角，平稳向前推动至载玻片的另一端，玻片上便留下一均匀薄层血膜，自然干燥。2.染色--①将干燥后的血膜片置于染色架上。②用瑞氏染液3～5滴，覆盖整个血膜，固定细胞0.5～1min。③滴加等量或稍多的缓冲液于血膜上，用吸球将其吹匀，染色5～10min。④平放玻片，用流水从玻片的一侧冲去染液，待血片自然干燥或用滤纸吸干，即可镜检。3.镜检--在低倍镜下观察细胞着色情况，然后选择血涂片体尾交界部染色良好的区域滴加一滴香柏油，在油镜下按一定的方向顺序对所见到的每一个白细胞进行分类，既不得重复亦不遗漏，共计数100个白细胞。求出各类白细胞所占的百分率。瑞氏染色外周血五种白细胞形态特征：细胞类型大小（µm）外形细胞核细胞质核形染色质着色颗粒中性杆状核粒细胞10～15圆形弯曲呈腊肠样，两端钝圆深紫红色粗糙淡橘红色量多，细小，均匀布满胞质，浅紫红色中性分叶核粒细胞10～15圆形分为2～5叶，以3叶为多深紫红色粗糙淡橘红色量多，细小，均匀布满胞质，浅紫红色嗜酸性粒细胞11～16圆形分为2叶，呈眼镜样深紫红色粗糙淡橘红色量多粗大，圆而均匀，充满胞质，鲜橘红色嗜碱性粒细胞10～12圆形核结构不清，分叶不明显粗而不匀淡橘红色量少，大小和分布不均，常覆盖核上，蓝黑色淋巴细胞6～15圆形或椭圆形圆形或椭圆形，着边深紫红色块粗糙透明淡蓝色小淋巴细胞一般无颗粒，大淋巴细胞可有少量粗大不均匀，深紫红色颗粒单核细胞10～20圆形或不规则形不规则形，肾形，马蹄形，或扭曲折叠淡紫红色，细致疏松呈网状淡灰蓝色量多细小，灰尘样紫红色颗粒弥散分布于胞质中中性杆状核粒细胞中性分叶核粒细胞淋巴细胞单核细胞嗜碱性粒细胞嗜酸性粒细胞外周血各类白细胞的百分率及绝对值血涂片的制备五注意事项：1.所制血膜片一定要均匀，厚薄适宜，头、体、尾分明。2.玻片需清洁，血膜干透后才可固定染色。3.染色时间的长短与染液的浓度、室温高低及有核细胞多少有关。染液浓度愈小、室温愈低、细胞愈多、所需时间愈长。必要时可增加染液量或延长时间。4.染液不宜过少，以免蒸发干燥，导致染料沾着于血膜上不易冲掉。5.冲洗时不可先倒掉染液，应让流水从血膜一端缓缓将染液冲去，以免染料残渣附在血膜上。六思考题：白细胞分类计数的临床意义？实验四网织红细胞计数一实验目的：熟悉网织红细胞计数的原理和测定方法，掌握网织红细胞参考值及临床意义。二实验原理：网织红细胞是尚未完全成熟的红细胞，其胞质中含有核糖体、核糖核酸等嗜碱性物质，经新亚甲蓝活体染色后呈浅蓝或深蓝色的网状结构，可区别于完全成熟的红细胞。三实验器材和试剂：显微镜、10g/l新亚甲蓝染液，试管、载玻片、香柏油四实验步骤：1.取小试管1支加10g/l新亚甲蓝染液1滴。2.加入血液1滴于上述试管中，混匀。3.室温下放置10－15分钟后，取1滴制成血膜片。4.在低倍镜下选择细胞分布均匀，着色清晰的部位，用油镜计数1000个红细胞内网织红细胞数。五计算：网织红细胞百分数＝网织红细胞数/1000六参考值：成人：0.005-0.015(0.5%～1.5%)新生儿：0.03-0.06(3%～6%)七注意事项：1.网织红细胞必须用新鲜血液活体染色才能显示，染液与血液的比例1：1为宜2.血膜制备技术很重要。红细胞应均匀散开，如有重叠则影响结果的准确性。网织红细胞体积较成熟红细胞体积稍大，多分布于涂片的尾部及两侧，故进行计数时应巡视整个血涂片中网红细胞分布情况再进行计数。3.染料配制前必须过滤，放置保存过程中应防止有任何沉淀出现以影响计数结果。4.为便于计数，可使用米勒窥盘进行计数。5.血液与染液混合时间必须足够长。八思考题：网织红细胞的临床意义？Miller窥盘为一厚1mm，直径19mm的圆形玻片，玻片上的微细刻线划分成大小两个正方形。B为小正方形，A为大正方形。B位于A之内，如附图所示。其中B的边长为A的边长的1／3，故其面积为A的1／9。将Miller窥盘置于接目镜内检测网织红细胞涂片。用小正方形（B）计数红细胞,大正方形（A）计数网织红细胞数,再接下式计算:网织红细胞%=A格内网织红细胞/（B格内红细胞数×9）×100%实验五凝血酶原时间（PT）测定凝血酶时间（TT）测定一实验目的：掌握PT,TT实验的原理、操作方法和临床意义。二实验原理：PT原理：在受检血浆中加入足量的凝血活酶和钙离子，测定血浆凝固所需的时间，即为血浆凝血酶原时间。本试验是外源性凝血系统常用的筛检试验，此外，常利用本试验对口服抗凝剂治疗进行监控。TT原理：受检血浆中加入标准化的凝血酶溶液后，测定血浆凝固所需要的时间，即为血浆凝血酶时间，TT主要用于检测血浆纤维蛋白原的减少或抗凝物质的增多。三实验试剂和器材：待测血浆、37度水浴箱、硅化试管、秒表、加样枪、氯化钙凝血活酶试剂、凝血酶溶液。四实验步骤：PT:取待测血浆0.1ml，37℃孵育3分钟，加入37℃预温PT试剂0.2ml,记录凝固时间，即为PT值。TT：取37℃预温待测血浆0.2mL,加入TT试剂0.2ml，记录凝固时间，即为TT值。注意：TT试剂不需37℃预温，15-25℃室温直接使用。五参考值：PT10-14秒TT10-16秒六注意事项：1.采血必须使用一次性塑料注射器或硅化玻璃注射器，贮血必须使用塑料试管或硅化玻璃管。2．血浆分离后应尽快测定。3．血浆预温不宜超过10分钟。4．凝血活酶预温不可超过30分钟。5．待测血浆应使用0.109mo1／L枸橼酸钠抗凝。6．手工操作时，凝血酶原和凝血酶时间的终点计算以出现混浊的初期凝固为准。7.测定温度36．5～38．5℃，过低或过高温度均使PT、TT延长。•七临床意义：1.PT延长：见于先天性凝血因子异常，如因子Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ缺乏症；后天性凝血因子异常，如弥漫性血管内凝血、原发性纤溶、维生素K缺乏症、严重肝病；血循环中有抗凝物质，如口服抗凝剂、肝素和FDP等。2．PT缩短:见于高凝状态和血栓性疾病、先天性因子Ⅴ增多症、口服避孕药等。3.TT延长：以DIC时纤维蛋白原消耗为多见，也有部分属于先天性低（无）纤维蛋白原血症、原发性纤溶及肝脏病变。也可见于肝素增多或类肝素抗凝物质增多。4.TT缩短：极为罕见，主要见于某些异常蛋白血症或巨球蛋白血症时，此外较多是技术原因，如标本在4度环境中放置过久，组织液混入血浆等。实验六尿常规检查•尿液的常规检查包括：物理学检查：尿量、气味、颜色、透明度化学检查：蛋白、糖、PH、酮体、尿胆红素、尿胆原、尿亚硝酸盐、尿隐血、白细胞、比密、维生素C尿沉渣（显微镜）检测：尿液细胞、管型、结晶、上皮等•一般性状检查：•1、尿量：正常尿量1000-2000ml/24hr平均1500ml•少尿：400ml/24hr或持续17ml/hr•无尿：100ml/24hr•多尿：2500ml/24hr•2.尿液外观：•正常尿的颜色：多为澄清透明至淡黄色或琥珀色，•颜色常受食物、药物、尿色素（尿胆原、尿胆素、尿卟啉）的影响。•病理性尿液外观1.血尿：尿中含有一定量红细胞，可呈淡红色云雾状、水洗肉样（量少时）、红色血凝块（量多时）。2.肉眼血尿：每升尿中含血量超过1ml，即可出现淡红色。3.显微镜血尿：尿外观无明显变化，离心沉淀后镜检，平均3RBC/Hp4.血红蛋白尿：可使尿液呈浓茶色、红葡萄酒色或酱油色。隐血试验为阳性（正常尿液试验隐血为阴性）血红蛋白尿：见于严重的血管内溶血：阵发性血红蛋尿、蚕豆病、血型不合的输血反应。5.胆红素尿：尿就中含有大量结合胆红素，呈豆油样改变，振荡后出现黄色的泡沫且不易消失。•常见：阻塞性黄胆和肝细胞性黄疸。6.脓尿和菌尿：新