小儿肺炎的病原学诊断

小儿肺炎的病原学诊断陈志敏浙江大学附属儿童医院呼吸科肺炎病原学诊断的重要性•对几乎所有肺炎患儿的初始治疗都是经验治疗•下列情况下病原学诊断很重要–重症难治性肺炎–免疫抑制者肺炎–呼吸机相关性肺炎–其它有基础疾病患者•正确应用与解释病原学检查结果更重要病原学诊断的依据--直接病原学证据•病毒学诊断方法•支原体感染的诊断•细菌感染的诊断•其它病原的检测病毒病原学：确诊依据标本方法NPA或痰病毒分离血双份血清抗体测定(IgG滴度升高4倍以上)NPA:鼻咽吸出物（脱落细胞）病毒病原学：快速诊断标本方法NPA或痰病毒抗原检测(ELISA,CIE,COA,LA,RIA)病毒核酸测定(PCR,RT-PCR,Geneprobe)血血特异IgM(IgMcapture,IFA)病毒抗原的快速检测是病毒感染早期诊断的主要方法之一–包括免疫荧光法检测呼吸道脱落上皮细胞内的病毒抗原、酶免疫法或金标法检测呼吸道分泌物中的病毒特异性抗原等。–直接免疫荧光法检测试剂盒在国内和国外实验室普遍应用，可快速检测4种7型常见的呼吸道病毒.病毒检测方法的比较影响病毒抗原检测的主要因素•标本采集时间•标本质量•检测试剂的质量•实验技术影响病毒抗原检测的主要因素•假阴性–细胞数量少–抗原检测试剂敏感性差–实验技术操作问题–疾病后期（不再排病毒）•假阳性–抗原检测试剂特异性差病毒特异性抗体测定–机体感染病毒后首先出现特异性IgM反应，随后IgG抗体水平升高–血病毒特异性IgM水平的升高对病毒感染的早期诊断有一定的价值。–更有价值的是抗体水平的进行性升高，急性期和恢复期（间隔10-14天以上）双份血清特异性IgG抗体比较有4倍以上的升高可作为病毒感染诊断的可靠指标。PCR技术的应用•聚合酶链反应（PCR）或逆转录PCR(RT-PCR)检测呼吸道分泌物中的病毒特异性基因片段，具有很高的敏感性，特异性强，具有早期诊断价值。•实时PCR（real-timePCR）等技术的发展不但提高了检测敏感性，同时减少了操作步骤与污染的机会•多重PCR、巢式PCR等技术的应用进一步提高敏感性与特异性。影响DNA检测的主要因素•假阳性–标本污染–正常携带？•假阴性–实验技术（血性标本、抽提损失等）–疾病后期病毒检测方法的比较80例婴儿下呼吸道感染NPA标本•DFA阳性率32.5%•细胞培养阳性21.3%•RT-PCR阳性27.0%MikrobiyolBul.2009Jul;43(3):433-8.病毒检测方法的比较以细胞培养为金标准•敏感性特异性阳性阴性预测值预测值•DFA100%85.7%65.4%100%•RT-PCR100%94.7%85%100%MikrobiyolBul.2009Jul;43(3):433-8.肺炎支原体实验室诊断临床怀疑肺炎支原体感染者应进行肺炎支原体检测年龄季节临床表现辅助检查肺炎支原体：确诊标本方法NPS或痰支原体分离血双份血清抗体测定(IgG滴度升高4倍以上)NPS:鼻咽分泌物肺炎支原体：快速诊断标本方法NPS或痰支原体抗原检测(ELISA,CIE,COA,LA,RIA)支原体核酸测定(PCR,Geneprobe)血血特异IgM(IgMcapture,IFA)冷凝集素试验•对MP感染的诊断有一定的价值，感染后2-3周效价最高，方法简单•敏感性与特异性均不足，低于1：64特异性较差，肝病、溶血性贫血、传染性单核细胞增多症患儿可能出现假阳性结果。MP检测的血清学方法•补体结合试验•免疫荧光分析•间接血凝试验•颗粒凝集试验•酶联免疫吸附试验•酶免疫分析ELISA测定IgM•将已知的抗原吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。•根据ELISA所用的固相载体区分：微量板ELISA；斑点ELISA；布ELISA。•在微量板ELISA中，又根据其性质不同分为间接ELISA、双抗体夹心ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA。血清抗体检测的特点•优点–敏感性高–特异性强–抗菌治疗影响小•缺点–产生与消失的时效性–受免疫功能的影响–交叉反应IGM假阴性•感染早期•6个月以下的婴儿•重复感染•体液免疫缺陷或受抑制IGM假阳性•新近感染•判断标准过低•试剂与操作问题•交叉反应PCR结果的影响因素•引物设计P1、16SrRNA、16S-23SrRNAspacer、ATP酶操纵子、tuf、parE、dnaK、pdhA、repMpI、CARDS基因•PCR方法•取材质量理想标本的来源没有共识，鼻咽标本、痰及肺泡灌洗液、胸水均可用于PCR•疾病时期感染后长期带菌？•技术因素PCR与间接颗粒凝集试验的比较KimNH.PediatrInfectDisJ.2007;26(10):897-903.PCR更适用于年幼和免疫损害患儿MP感染的早期诊断PCR阳性而血清学阴性患儿常更为年幼、免疫功能常有损害1岁以内MP感染者血清抗体滴度明显低于5岁以上患儿PCR阳性MP感染患儿咳嗽病程明显短于依据血清学诊断而PCR阴性的患儿肺炎衣原体•培养：至少需7天。•PCR•血清学：最为常用，如补体结合试验、全包涵体荧光检查、酶免疫分析、微免疫荧光试验，后者是目前血清学诊断CP的金标准。双份血清抗体4倍以上升高或单份血清特异IgM1：32以上（MIF法）可确诊肺炎衣原体•ELISA测定CP特异IgM有较高的假阳性–类风湿因子、抗核抗体、慢性阻塞性肺部疾病、胶原相关性间质性肺病–肺炎支原体感染也是导致假阳性的重要原因。痰细菌培养的困惑•阴性不能排除–标本不合格、送检不及时–抗生素的早期应用–技术质控与培养基要求•阳性不能确定–咽部污染：正常菌群？–抗菌药物使用或有结构性肺病：定植菌？抗菌药物的选择痰细菌培养的困惑：对策•无菌标本培养，如胸水、血•受早期抗菌药物的影响EdaUtineG,etal.Respiration,2008,75:437EdaUtineG,etal.Respiration,2008,75:437实验室检查方法比较--儿童胸腔积液（n=190)•血培养阳性8.5%（14/165）–血浆PCR阳性26.4%（37/140）•胸水培养阳性22.4%（22/134）–胸水PCR阳性64.9%（72/111)Hernandez-BouS,etal.PediatrPulmonol,2009,44:1192胸水培养与PCR结果比较Hernandez-BouS,etal.PediatrPulmonol,2009,44:1192常规与PCR诊断EurJPediatr,2010,169:581-584痰细菌培养的困惑：对策•无菌标本培养：如胸水、血（受早期抗菌药物的影响）+PCR•呼吸道标本定量培养痰细菌培养的困惑：对策•无菌标本培养：如胸水、血（受早期抗菌药物的影响）+PCR•呼吸道标本定量培养•其它–呼吸道标本半定量培养37培养结果:有诊断意义•合格痰标本培养优势菌中度以上生长（=+++）；•合格痰标本培养少量生长，但与涂片镜检结果一致（肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌）；•入院3天内多次培养到相同细菌。提高痰标本的价值•痰标本是否合格：痰涂片细胞学检查-中性粒细胞≥25个/低倍视野，上皮细胞＜10个/低倍视野为合格标本；•无菌生理盐水漂洗痰标本：明显提高其诊断价值，尤其是经漂洗过的痰标本病菌生长量明显多于鼻咽或咽拭子标本培养结果时常提示病原菌；•漂洗痰标本涂片革兰氏染色如发现在肺泡巨噬细胞周围或细胞内有病菌常有较高的诊断价值。PediatrInternational,2011,53:264痰细菌培养的困惑：对策•无菌标本培养：如胸水、血（受早期抗菌药物的影响）+PCR•呼吸道标本定量培养•其它–呼吸道标本半定量培养–细菌抗原检测细菌抗原测定•对非呼吸道标本如尿、胸水进行细菌抗原检测•肺炎链球菌荚膜多糖抗原、溶血素抗原、PpmA(putativeproteinasematurationproteinA)、流感嗜血杆菌抗原•与传统细菌培养相比，敏感性明显提高不推荐尿肺炎链球菌检测•尿肺炎链球菌抗原与痰肺炎链球菌培养结果有较好的相关性。但尿肺炎链球菌抗原阳性不能完全鉴别带菌者与感染•儿童上呼吸道肺炎链球菌携带率高，尤其是5岁以下健康儿童或上呼吸道感染儿童中鼻咽拭子肺炎链球菌分离率达20-40%，冬季携带率更高。•肺炎链球菌疫苗接种后48小时内亦可阳性。•阳性结果不能作为确诊依据，阴性价值更大