Trizol法提取细胞中RNA及逆转录合成cDNA

Trizol法提RNA试剂及材料：Trizol（3号冰箱4℃3层）、三氯甲烷、异丙醇（以上二者在有机厨）、75%乙醇（按DEPC水:无水乙醇=1：3配制）、DEPC水（以上二者在3号冰箱—20℃3层）、肺动脉平滑肌细胞仪器：4℃离心机、移液枪、Nanodrip2000(微量紫外分光光度仪)、1.5mlEP管、200μlEP管、EP管插板、冰盒准备：1、配制DEPC水：取一个500ml蓝盖瓶，用去离子水洗涤，加入超纯水500ml,想瓶中加入DEPC母液0.5ml,震荡摇匀，在通风厨内常温过夜，灭活RNA酶，第二天将瓶子盖拧松，高温高压消毒灭菌（121℃，30min）,消毒后分装在1.5mlEP管中，4℃保存。2、新鲜标本的保存（备用于RNA提取）：取新鲜标本，先放入液氮中，然后冻存于-80℃。3、动物组织提RNA前处理：用PBS冲洗干净后，按50-100mg加入1mlTrizol，用电动匀浆器或者一次性研磨杵充分匀浆，最好在冰上进行。注：均质50-100毫克组织样本需要1毫升的TRIzol试剂，使用特富龙玻璃®或强力均质机（Polytron,orTekmar'sTISSUMIZER®TISSUMIZER®或相当的仪器）。均质时样本体积不应超过TRIzol试剂体积的10％。b.单层细胞直接在培养皿中裂解细胞，3.5厘米直径的皿中加入TRIzol试剂1毫升，并通过抽吸几次促进细胞裂解。TRIzol试剂的添加量基于培养的面积而不是细胞的数目（每10平方厘米加入1毫升）。TRIzol试剂量不足可能会导致分离出的RNA有DNA的污染。步骤：1.将处理完的35mm细胞皿从细胞培养箱中取出，用预冷的PBS清洗1-2次，迅速加入已经预冷的Trizol液1ml，室温孵5分钟。2.收集标本悬浮于1.5mlEP管内，加入200ul三氯甲烷，用手上下震荡15秒，使之充分混匀成乳状，室温孵育3分钟。3.标本12000rpm，4℃离心15分钟（离心机提前预冷），然后小心取出离心管，置于冰上（注意：避免摇晃）。4.用枪头慢慢吸取上清液（尽可能多吸，但避免吸到中间白色蛋白层），置于一新EP管中。5.向管中加入0.5ml异丙醇，混匀，室温孵育10分钟。6.标本再置于离心机内，12000rpm，4℃离心10分钟。7.弃上清，加入事先配好的75%乙醇1ml（用DEPC水和100%乙醇配制），震荡，7500rpm4℃离心5分钟。8.倒掉上层乙醇，并保持离心管于倒置状态固定于离心管架上，待酒精挥发干（干燥5-10min即可）。若管壁残留酒精较多，可用枪头吸干，但避免吸到RNA沉淀。9.加入20ulDEPC水，枪尖置于液面下吹打3次，混匀。室温放置5-10分钟，溶解RNA。10.置于冰上，吸取1ulRNA样本用紫外核酸蛋白分析仪（14楼）测RNA浓度。评价标准：260/280接近2，不低于1.8才可用。测RNA浓度步骤：准备一管DEPC水（空白对照）；a、连接nanodrip2000,打开电脑桌面软件b、nuclide---TYPE选择RNA---加1-2ul水---点击Blank来进行空白对照检测并保存参比图谱，虽然不需要在每个样品之间进行空白校准，但我们建议在检测多个样品时，最好每30min进行一次空白校准。30min后，最后一次做空白检测的时间将显示在软件下面的状态栏上。c、用无尘纸擦干上下基座上的样品后，再加1-2ul水---点击measure，结果应该是差不多为一水平线，吸光值变化应不超过0.04A（10mm光程），显示浓度在+—0.5以内。d、用无尘纸擦干上下基座上的样品后，再加入待测RNA溶液1ul，读数。11.—80℃保存或供逆转录用即可。RNA逆转录合成cDNA试剂：TakaRa试剂盒（#AK5301）仪器：PCR仪步骤：1.计算RNA需要量：反应体系中所需RNA的量为1000ng，体系为20ul(10ul+10ul)。用200ulEP管，加入RNA的体积为V=1000ng/RNA浓度。剩余体积用无RNA酶的水（试剂盒内有）定容至10ul。样本RNA体积RNA酶FeeH2O13.336.6725.534.4735.644.36NC5.474.536812.627.382.配制反应试剂混合液（Takara试剂盒，2号冰箱，—20℃，一层）。RANFeeH2O3185XPrimBuffer424（最后再加）PrimRTEnzyme16Rando引物16Oligo引物16总体积1060（总共配的份数要比需要的多2个体系，原因：有损耗）3.吸取10ul反应混合物加至每管（每管10ul反应试剂混合物+10ulRNA液），混匀后置于冰上，14楼行逆转录。（1）37℃15分钟（反应时间）（2）85℃5秒钟（逆转录酶失活）（3）4℃保存（相当于4℃冰箱）操作步骤：开机—fiels—precious—CYQ—run（21min）4将cDNA产物稀释10倍（20ul产物+180ulDEPC，根据实际情况，组织样本可以稀释20倍，RNA提的不好的话可以稀释5倍），-20℃保存待用。