外源基因在大肠杆菌中表达简略实验步骤

目的基因在大肠杆菌中的诱导表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。[主要试剂]1、LB培养基。2、100mMIPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38gIPTG溶于100mlddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。[操作步骤]1、通过PCR方法获得目的基因：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，本实验中为BamHⅠ和HiindⅢ），PCR循环获得所需基因片段。PCR反应体系为：模板（含R基因的重组质粒）1μl上游引物PR11μl下游引物1μldNTP（2.5mmol/L）5μl10×PCRbuffer（含Mg2+）10μlTaq酶1μlddH2O补至100μlPCR反应条件为：94℃变性3min；94℃变性3min、52℃复性40sec、72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min。2、构建重组表达载体（1）载体酶切：将表达质粒pRSETA用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用凝胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。（2）R基因PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。连接反应体系为：pRSETA1μlR基因片段3μlT4DNA连接酶（5U/μl）1μl5×buffer2μlddH2O补至10μl3、获得含重组表达质粒的表达菌种（1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。（2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。（3）以此重组质粒DNA转化表达宿主菌BL21（DE3）的感受态细胞。4、诱导表达1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2mlLB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含100mlLB培养基的300ml培养瓶中,37℃震荡培养至OD600≌0.5-0.8（最好0.6，大约需3hr）。3、取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mM作为实验组，两组继续于37℃、200rpm震荡培养3hr。4、分别取菌体1ml,，离心12000g×30s收获沉淀，用100μl1%SDS重悬，混匀，70℃10min。5、离心12000g×1min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。65500rpm15min收集细胞7溶菌酶破碎细胞制备过柱上清8过柱纯化带组氨酸标签蛋白