手足口病的实验诊断

手足口病的实验诊断安徽省疾病预防控制中心2009.3.11手足口病的病原手足口病（hand-foot-mouthdisease,HFMD）由人肠道病毒感染引起。人肠道病毒为小RNA病毒科（Picornaviridae），肠道病毒属（Enterovirus）的一组单股正链RNA病毒。其中包括埃可病毒（31个血清型）、柯萨奇病毒A组（23个血清型）和B组（5个血清型），还包括3个脊髓灰质炎病毒血清型和人肠道病毒68-71型。CourtesyofLindaM.Stannard,UniversityofCapeTown,S.A.h~30nm二十面体对称无包膜人肠道病毒的毒粒结构人肠道病毒发现的历史脊髓灰质炎病毒：1909年首次鉴定出该病毒，1949年，利用细胞培养的方法增殖病毒，为疫苗的研制奠定了基础。柯萨奇病毒：1948年在美国纽约Coxsackie镇，将两名麻痹患儿的标本接种至乳鼠体内，分离出来的一组病毒定名为柯萨奇病毒。根据它们在乳鼠上产生的组织病理学变化和在细胞培养上的能力，分为柯萨奇病毒A组和B组。埃可病毒：1951年在一名无症状的儿童的粪便标本中分离到，在细胞培养上可以造成致细胞病变，但对乳鼠和灵长类动物不致病。新肠道病毒：随后新发现的病毒被按照序号命名（69~71），最近，已经命名至102型肠道病毒主要血清型手足口病的常见致病病原多种肠道病毒都可引起HFMD，主要为：柯萨奇病毒A组的4～7、9、10、16型B组的1～3、5型埃可病毒的部分血清型肠道病毒71型最常见的为CV-A16和EV71肠道病毒的抵抗力肠道病毒无包膜，乙醚、75%酒精、表面活性剂等均不能将其灭活。对紫外线及干燥敏感；各种氧化剂（高锰酸钾、漂白粉等）、甲醛或56℃30min都能灭活病毒病毒在4℃可存活1年，-20℃可长期保持感染性病毒RNA有感染性。（一）粪便标本采集病人发病7日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量5～8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。（二）脑脊液标本出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标本，进行病原和抗体检测。采集时间为出现神经系统症状后3日内，采集量为1.0～2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。手足口病的标本采集手足口病的标本采集（三）血清标本采集急性期(发病0～5天)和恢复期(发病14～30天)双份配对血清用于抗体检测。检测IgM时，采集(发病7～20天)血。静脉采集3～5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清置于－20℃以下冰箱中冷冻保存。（四）咽拭子标本采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3～5ml保存液（细胞维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。（五）疱疹液可同时采集多个疱疹作为一份标本，用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3～5ml保存液（维持液或生理盐水）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。手足口病的标本采集标本采集器械要求注射器：医用（5ml和10ml）一次性注射器棉拭子：塑料杆全血收集管：10ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)血清保存管：2ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存）粪便保存管：5-20ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存）-全国POLIO网络实验室鼻咽拭子保存管：10ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存）痰液保存管：50ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存）尸检组织冻存管：50ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)；尸检（每一个样品换手术刀）记号笔：油性，防水标本采集器械要求病人标本的采集运输和保藏在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液或脑脊液中分离病毒具有很高的诊断价值。用于采集咽拭子的无菌拭子要放在适当的保存液中，如维持液或生理盐水，以防干燥。标本采集注意事项标本采集注意事项•为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测。•不能立即检测的标本应冷冻保存。•对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病2-4周后采集。手足口病的诊断一般是通过采集适当的临床标本后进行基因检测、抗原检测、血清学抗体检测、病毒分离和病鉴定手足口病的实验室诊断手足口病的实验室诊断方法病毒分离抗体检测核酸检测蛋白/核酸芯片标本病毒分离CPE阳性RT-PCR及序列测定肠道病毒非肠道病毒测双份血清中和抗体滴度RT-PCRRealtimeRT-PCR检测病毒核酸序列测定无CPE常规实验补充实验中和定型手足口病的实验室检测流程病毒分离培养用于病毒分离的标本：包括粪便、咽拭子和疱疹液，如果患者出现神经系统症状，可以采集脑脊液标本适用的细胞RD细胞（人胚胎横纹肌肉瘤细胞）、Hep-2细胞（人喉上皮癌细胞）病毒分离培养标本的处理1、粪便：2g加PBS10ml，振荡混匀，1500g低温离心20min，上清0.2ml接种敏感细胞2、咽拭子：于采样管中充分洗涤拭子，4℃下10000rpm离心20min，上清0.2ml接种敏感细胞3、脑脊液和疱疹液：直接接种病毒分离培养培养观察：36℃培养逐日观察，第1代培养见可疑CPE至观察满7天后再继续冻融传代，待稳定CPE出现后,-20℃或-70℃冻存以备进一步鉴定；如果7天之后没有出现CPE，需盲传2代继续观察，盲传2代后仍不出现CPE则判定为阴性；鉴定：中和试验血清抗体检测方法中和实验、ELISAIgM：单份血：急性期IgG：双份血：急性期，恢复期阴转阳，四倍升高，四倍降低均可诊断近期感染病毒核酸检测—RT-PCRRT-PCR(ReverseTranscriptasePCR)用于RNA病毒的检测，酶促催化使RNA逆转录成cDNA第一链，逆转录与第一次PCR在同一系统内进行，逆转录完成后，加热灭活逆转录酶，然后开始PCR扩增。一条寡聚脱氧核苷酸引物先与mRNA杂交，然后由依赖RNA的DNA聚合酶催化合成相应互补的cDNA拷贝，后者能进一步用于PCR扩增。病毒核酸检测—RT-PCR方法特点：快捷、简便高度灵敏、特异具有病原诊断意义高效的通用型技术平台粪便标本：采用氯仿进行处理。肛拭子/咽拭子标本：咽拭子要在标本保存液中充分搅动，然后在4℃下，10000rpm离心20min。疱疹液和脑脊液：直接用于RNA提取。标本的预处理可使用商业化试剂盒从临床标本中提取病毒RNA简化操作、规范方法、条件一致、排除干扰QIAGENViralRNAMiniExtractionKit（CAT：52904）适合临床标本和病毒培养物标本QIAGENRneasyMiniKit（CAT：74104）适合组织和咽拭子标本RNA的提取引物人肠道病毒（包括EV71、CA16、CA24v、EV70）核酸检测通用引物PE2（上游）：5`-TCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCC-3`PE1（下游）：5`-ACACGGACACCCAAAGTAGTCGGTCC-3`EV71核酸检测引物序列：EV71-S（上游）：5`-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3`EV71-A（下游）：5`-ATTTCAGCAGCTTGGAGTGC-3`引物CA16核酸检测引物序列：CoxA16-S（上游）：5`-ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3`CoxA16-A（下游）；5`-TCAGTGTTGGCAGCTGTAGG-3`引物根据自己实验室的实际情况建立各自RT-PCR反应体系配下列试剂主溶液：10×PCRBuffer（含Mg2+）·················································5.0μldNTPs（2.5mMeach）·······················································2.0μl上游引物（0.1μg/μl）························································1.0μl下游引物（0.1μg/μl）························································1.0μlRNA酶抑制剂（RNasin,40U/μl）······································0.5μlTaqDNA聚合酶（5U/μl）·················································0.5μlAMV逆转录酶（10U/μl）··················································1.0μl模板RNA··········································································3.0μlRNaseFreedH2O···························································36.0μl50.0μl反应体系在PCR仪上进行RT-PCR反应，反应步骤如下：42℃························45min95℃························3min95℃························20s50℃························25s×32个循环72℃························30s72℃························10min4℃························Soak温度循环参数通过比较标本的PCR产物与阳性对照的PCR产物在凝胶上的位置以及大小来解释结果。结果解释RT-PCR实验结果解释实验室诊断原则人肠道病毒在自然界广泛存在且种类繁多，一病多原、一原多症是肠道病毒感染的重要特征。因而应对血清诊断及病原诊断的实验室结果作严格评价，必须结合临床症状及环境因素流行病学分析，以确立病毒与疾病的病原学关系。一般采取的原则为：（1）病毒分离阳性率远高于对照人群；（2）病程中有特异性抗体变化并排除其他病毒感染；（3）从病变组织中分离出病毒。从疑为肠道病毒感染的脑炎/脑膜炎患者的脑脊液中检测到相应的肠道病毒核酸（RT-PCR法），或分离到病毒或肠道病毒IgM阳性，即可证明是该肠道病毒引起的中枢神经系统感染。从疑为死于EV71（或其它肠道病毒）的尸检标本中检测到相应的肠道病毒核酸，或分离到病毒或肠道病毒IgM阳性，即可证明是该肠道病毒是病因。从HFMD患者的疱疹液中检测到相应的肠道病毒核酸，或分离到病毒，那么该病毒就是病因病原。实验结果的诊断意义实验结果的诊断意义当无法进行病毒分离或未分离到病毒时，血清学诊断方法可以作为病毒感染的间接证据。肠道病毒有时引起无症状感染，只从个别HFMD患者粪便标本中分离到EV71（或其它肠道病毒）时，不能轻易下结论EV71是病因，应该扩大样本量，所以实验结果的实际意义应结合临床过程和流行病学资料进行解释。手足口病检测实验室相关问题1、实验室生物安全问题：必须重视的问题实验人员受过生物安全培训①有防范潜在生物危害的意识②熟悉生物安全规程，掌握生物安全技能实验室自己的生物安全指南