2019年中医药干预载脂蛋白E基因敲除小鼠巨噬细胞泡沫化机制研究.ppt

中医药干预载脂蛋白E基因敲除小鼠巨噬细胞泡沫化机制研究张文高（山东中医药大学）刘美霞（中国中医科学院西苑医院）刘龙涛（中国中医科学院西苑医院）姜浩（北京中医药大学）朱莹（广东省中医院）吴敏（中国中医科学院广安门医院）2011年11月19日河南郑州相关课题获得的基金资助国家自然科学基金（30472275）高等学校博士学科点专项科研基（20060441002）中国博士后科学基金（20070410622）重视对动脉粥样硬化泡沫化细胞形成的干预研究中医药干预载脂蛋白E基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化及其机制研究本研究成果的临床应用提纲第一部分重视对动脉粥样硬化泡沫化细胞形成的干预研究背景动脉粥样硬化（As）心脑血管疾病共同的病理基础国内外心脑血管领域探讨的热点和重点泡沫细胞的生物学特征•泡沫细胞是As斑块内特征性病理细胞•是As的早期标志•在形态学上，细胞浆内脂质成分明显增多，并聚集成滴，镜下可见胞浆呈泡沫样改变；•细胞内总胆固醇增加，且胆固醇酯占总胆固醇的一半以上。两种来源的泡沫细胞As泡沫化细胞单核巨噬细胞泡沫化平滑肌细胞泡沫化As斑块内特征性病理细胞As的早期标志主要产生于As损伤的早期是中后期As病变的主要病理细胞成分炎症介质与泡沫细胞形成•内源性炎症介质氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）及外源性炎症介质脂多糖（LPS）均能促进、诱导泡沫细胞的形成。抑制泡沫细胞形成是阻止As发生发展的重要途径•大量泡沫细胞堆积形成脂质条纹乃至脂质斑块；•斑块的进一步破裂、出血及血栓形成会导致各种心脑血管事件的发生。•泡沫细胞形成是As发生发展的关键环节。•抑制泡沫细胞形成是阻止As发生及进一步发展的重要途经。•对泡沫细胞的早期积极干预是防治As及相关心脑血管疾病的重要途径。前期研究的回顾脂欣康干预SD大鼠血管平滑肌细胞泡沫化的研究脂欣康胶囊人参皂苷银杏叶提取物三七总皂苷牛磺酸茶多酚功效成分组方中医药功效：益气活血解毒化浊平滑肌细胞的培养与鉴定VSMC的培养鉴定VSMC萌出10x40纯化VSMC10x40α-smoothmuscleactin免疫荧光化学染色显示肌丝10x40ox-LDL诱导细胞泡沫化及鉴定油红O染色观察VSMC内脂质10x40平滑肌细胞泡沫化平滑肌细胞培养ox-LDL培养48h油红O染色后，镜下可见细胞内有大小不等的脂滴，胞浆呈泡沫样改变，高效液相色谱法检测，胆固醇酯占总胆固醇的60%以上，表明平滑肌细胞泡沫化成功分组及制备含药血清20只200g左右雄性SD大鼠随机分为5组脂欣康组血脂康组洛伐他汀组罗格列酮组生理盐水组灌胃5天取血，制备含药血清研究分组•A脂欣康组•B血脂康组•C洛伐他汀•D罗格列酮组•E生理盐水组•F空白对照组——不加含药血清分别加入含药血清含药血清干预时间——48小时对泡沫细胞内总胆固醇含量的影响各组平滑肌源性泡沫细胞内总胆固醇含量比较高效液相色谱法检测胆固醇含量（高效液相色谱法）对泡沫细胞内胆固醇酯含量的影响各组平滑肌源性泡沫细胞内胆固醇酯含量比较高效液相色谱法检测胆固醇酯含量（高效液相色谱法）对总胆固醇与胆固醇酯比值的影响空白对照组生理盐水组洛伐他汀组罗格列酮组血脂康组脂欣康组总胆固醇与胆固醇酯的比值62.75%63.46%47.63%42.25%38.04%37.13%激光共聚焦显微镜观察细胞内Ca2+浓度光镜观察空白对照组10x40生理盐水组10x40洛伐他汀组10x40脂欣康组10x40血脂康组10x40罗格列酮组10x40激光共聚焦显微镜观察图像对细胞内Ca2+浓度的影响各组平滑肌源性泡沫化细胞内Ca2+浓度的平均荧光强度值激光共聚焦显微镜检测泡沫细胞内Ca2+浓度（激光共聚焦显微镜）对VSMC源性泡沫细胞内CD36mRNA表达的影响光镜观察空白对照组10x40生理盐水组10x40洛伐他汀组10x40脂欣康组10x40血脂康组10x40罗格列酮组10x40原位杂交法检测B类清道夫受体CD36mRNA表达（原位杂交法）对VSMC源性泡沫细胞内CD36mRNA表达的影响各组平滑肌源性泡沫细胞内CD36mRNA表达比较B类清道夫受体白细胞分化抗原36配体（CD36）（原位杂交法）小结•脂欣康具有与洛伐他汀等相似的显著降低总胆固醇及胆固醇酯含量的作用，并且胆固醇酯与总胆固醇的比值均降至50%以下；•脂欣康具有与洛伐他汀相似的抑制平滑肌源性泡沫细胞内CD36mRNA表达的作用，并且优于洛伐他汀；•脂欣康可显著降低平滑肌源性泡沫细胞内的Ca2+浓度，优于洛伐他汀及血脂康。小结脂欣康与血脂康均显著抑制ox-LDL诱导的VSMC泡沫化，从而抗As斑块形成，并有助于稳定斑块。其作用机制：•调脂、改善脂质代谢•降低细胞内钙负荷•抑制细胞内CD36mRNA的表达中医药对As泡沫化细胞干预研究其它学者研究工作抗氧化As泡沫化细胞调节血脂抑制炎症介质减少细胞外基质降解刺梨汁大黄醇提液甲基莲心碱漏芦马齿苋三七总皂苷扇贝裙边糖胺聚糖小檗碱益气活血化痰法等继续挖掘能够干预As泡沫化细胞的中药并对其作用机制进行深入研究，对于防治As具有重要的意义。激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）第二部分中医药干预载脂蛋白E基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化及其机制研究ApoE基因敲除小鼠AS模型ApoE基因敲除小鼠于1992年培育成功自然发生渐进发展病理形态典型病变接近于人类研究As的较理想动物模型ApoE基因敲除小鼠AS模型本科研团队的研究研究进程2000年开始，在国内外率先应用ApoE基因敲除小鼠开展心血管病与老年病中西医结合基础研究。2002年开始，发表系列论文。2002年，山东生物医学工程（第4期）：载脂蛋白E基因敲除小鼠在动脉粥样硬化研究中的应用；2003年，中西医结合心脑血管病杂志（第8期）：中西药物对载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化的干预作用；2003年，中国动脉硬化杂志（第5期）：血脂康对载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化的影响ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞模型•ApoE在体内胆固醇转运过程中作为脂蛋白配体发挥作用，•当ApoE缺乏时，由其诱导的胆固醇外流受阻，•ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞转化为泡沫细胞过程中，胆固醇酯蓄积更加明显，更容易形成As病变，是作为体外培养巨噬细胞源性泡沫细胞模型进行干预研究的较理想选择。中医药干预ApoE基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化及机制本科研团队的研究研究内容ApoE基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞体外培养泡沫化干预PPARγ、CD36、ABCA1信号通路抑制TLR4表达及炎症反应拮抗细胞内钙离子水平降低胆固醇浓度脉心康胶囊降脂红曲虎杖、山楂及其配伍一、脉心康干预ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞泡沫化及其机制研究方药组成：•人参•银杏叶•降脂红曲•绿茶•功效成分组方人参皂苷银杏叶提取物降脂红曲超微粉茶多酚中医药功效：益气活血解毒化浊脉心康胶囊研究分组•脉心康组•洛伐他汀组•罗格列酮组•生理盐水组•空白对照组——不加含药血清分别加入含药血清含药血清干预时间——72小时（激光共聚焦显微镜）脉心康对ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞内钙离子浓度的影响脉心康对ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞PPARγ蛋白表达的调控作用（免疫组化法，PPARγ蛋白表达）脉心康对ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1蛋白表达的调控作用（免疫组化法，ABCA1蛋白表达）脉心康对ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞CD36蛋白表达的调控作用（流式细胞术，CD36蛋白表达）脉心康对ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞PPARγmRNA表达的调控作用（原位杂交法，PPARγmRNA表达）脉心康对ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1mRNA表达的调控作用（原位杂交法，ABCA1mRNA表达）脉心康对ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞CD36mRNA表达的调控作用（原位杂交法，CD36mRNA表达）脉心康对ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞培养液TNF-α的影响0510152025303540451234脉心康组洛伐他汀组罗格列酮组生理盐水组空白对照组（ELISA法，TNF-α）脉心康对ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞培养液IL-1β的影响（ELISA法，IL-1β）脉心康对ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞内总胆固醇的影响总胆固醇检测0102030401234脉心康组洛伐他汀组罗格列酮组生理盐水组空白对照组（高效液相色谱法，总胆固醇）脉心康对ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇酯的影响胆固醇酯05101520251234脉心康组洛伐他汀组罗格列酮组生理盐水组空白对照组（高效液相色谱法，胆固醇酯）脉心康对ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇酯/总胆固醇比值的影响胆固醇酯与总胆固醇比值0102030405060701234脉心康组洛伐他汀组罗格列酮组生理盐水组空白对照组结论•以ox-LDL诱导24小时、48小时、72小时后，镜下观察可见巨噬细胞泡沫化程度随时间逐渐加重•脉心康含药血清干预后，细胞内胆固醇酯、总胆固醇含量及其比值均显著降低•细胞内钙离子水平显著降低•PPARγ、ABCA1蛋白及mRNA表达均显著增加•CD36蛋白及mRNA表达显著减少•细胞培养液中TNF-、IL-1β含量显著降低结论脉心康干预巨噬细胞泡沫化的机制，与以下几方面有关：•抑制胆固醇积聚•拮抗细胞内钙超载•激活PPARγ信号通路•抑制炎症反应ApoE（-/-）小鼠腹腔巨噬细胞培养分为B-G组与ox-LDL+LPS共孵育，并分别加药干预B虎杖苷C山楂提取物D虎杖苷山楂提取物组E洛伐他汀组F罗格列酮组G模型组A空白对照分别观察0、24、48h三个不同时相的以下指标变化WesternblotELISATLR4NF-BTNF-αIL-1β数据整理、统计分析二、解毒活血配伍干预ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞泡沫化及机制研究巨噬细胞泡沫化•以ox-LDL与LPS联合诱导ApoE基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化•联合诱导24小时及48小时•显微镜下观察可见巨噬细胞均泡沫化•泡沫化程度随时间逐渐加重•且以ox-LDL与LPS联合诱导组较单纯以ox-LDL诱导组泡沫化程度更明显•透射电镜下观察可见细胞内部结构呈不同程度破坏48小时空白组、模型组、解毒活血配伍组细胞电镜图片（6000)空白组模型组解毒活血配伍组透射电镜观察结果不同时相各组巨噬细胞内钙离子浓度的变化###**##*********（激光共聚焦显微镜）不同时相各组巨噬细胞内总胆固醇含量##**********不同时相各组巨噬细胞内游离胆固醇含量********不同时相各组巨噬细胞内胆固醇酯含量***####**********不同时相各组巨噬细胞内PPARγmRNA相对表达量*************######（RT-PCR法）不同时相各组巨噬细胞内ABCA1mRNA相对表达量**************######（RT-PCR法）不同时相各组巨噬细胞内CD36mRNA相对表达量**********######（RT-PCR法）不同时相各组巨噬细胞内TLR4蛋白相对表达量***********######（Westernblot法）不同时相各组巨噬细胞内NF-κB蛋白相对表达量***********#######（Westernblot法）不同时相各组巨噬细胞内TNF-α含量**************#####（ELISA法）不同时相各组巨噬细胞内IL-1β含量*************#####（ELISA法）结果虎杖苷、山楂提取物及两者配伍干预后：•明显减轻细胞内部结构破坏程度•显著上调细胞内PPARγ、ABCA1的mRNA表达,•下调CD36的mRNA表达•降低Toll样受体4（TLR4）、核因子-B（NF-B）、IL-1β及TNF-的表达•减少细胞内游离钙离子浓度•降低细胞内胆固醇酯、总胆固醇含量及其比值•两者配伍干预巨噬细胞泡沫化在部分指标方面明显优于单用虎杖苷或山楂提取物结