实验绿色荧光蛋白

生物技术实验报告姓名：张龙龙学号：2011506066班级：11级生技02班前言：绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP由3个外显子组成，长2.6kb；GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27.0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420nm，宽240nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成.一.实验目的1、了解表达用基因克隆引物设计的原理和方法。2、了解利用原核表达系统表达外源基因的原理、流程及方法。3、掌握PCR、DNA片段的酶切与连接、细菌转化、阳性克隆筛选、质粒提取、DNA样品的纯化、核酸电泳等分子生物学基本技术。二．实验原理基因工程一般包括四个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。本实验根据绿色荧光蛋白（GFP）的基因序列设计一对引物，用该引物将GFP基因从含GFP基因的质粒中扩增出来。再利用双酶切切开表达载体pET23b和目的基因的两端接头，通过T4连接酶GFP基因与表达载体重组。将含GFP基因的重组表达载体导入宿主菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下，使GFP基因表达三.实验材料及仪器1、实验材料：含有GFP的质粒；DNAMarker；DH5α；BL21；2、仪器：恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、制冰机、台式离心机、涡旋振荡器、冰箱、电泳仪、透射仪、PCR仪、PCR管、刀片、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、吸水纸、微型离心管、台式冷冻离心机、塑料手套、1.5ml离心管。四.实验内容4.1质粒的提取、酶切及电泳鉴定：1)实验试剂：LB培养基；溶液Ⅰ；Tris-HCl（pH=8）；溶液Ⅱ；溶液Ⅲ；酚/氯仿抽提液；无水乙醇；电泳缓冲液；加样缓冲液；GoldView核酸染色剂；1%的琼脂糖凝胶；XhoⅠ(10U/μl)；NdeⅠ（10U/μl）；T4DNAlisase。2)实验步骤：质粒的提取与鉴定（1）在含有质粒的DH5α平板菌落上挑取单菌落，接种于20ml含有100μl/mlApm的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜。（2）分装菌液到1.5ml离心管中，冰浴2min。4℃、12000rpm离心5min，收集菌体，弃上清。再用同样方法收集一次菌体。（3）将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，涡旋剧烈振荡，混匀，冰浴10min。（4）加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，轻柔快速颠倒离心管5次，充分混匀，冰浴5min。（5）加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，轻柔快速颠倒离心管数次，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置10min。4℃、12000rpm离心10min。（6）加等体积的酚/氯仿（1：1），震荡混合有机相和水相，冰浴3min。4℃、12000rpm离心10min，吸取上层水相转移到另一新离心管中。（7）加等体积的氯仿：异戊醇（24：1），振荡混合有机相和水相，4℃、12000rpm离心10min，吸取上层水相转移到另一新离心管中。（8）加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃沉淀DNA10-20min。4℃、12000rpm离心10min，弃上清，留沉淀（管底有少量白色沉淀）。（9）分2次加入1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min，抽吸去除所有上清，放置室温干燥，让酒精挥发。（10）加30μlTE（内含浓度50μg/ml的RNaseA）溶解DNA，37℃放置30min，消化RNA。-20℃保存备用。（11）制1%的琼脂糖凝胶：加25ml×TAE缓冲液于三角瓶。称取0.25g琼脂糖加到三角瓶中，与微波炉加热至完全溶化。冷却至60℃左右，加1μl的GoldView溶液，摇匀。轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30min以上。轻轻拔掉梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液（TAE）中，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm。（12）点样：取5μl质粒DNA及2μl加样缓冲液混合上样，80—100v约电泳20—30min。质粒DNA的酶切（1）酶切：按如下双酶切体系（20μl）混合反应物ⅠⅡ质粒5μl3μlXhoⅠ(10U/μl)0.5μl0.5μlNdeⅠ（10U/μl）0.5μl0.5μl10×buffer2μl2μlddH2O12μl14μl先加水，再加buffer，加质粒，加内切酶，放离心机上混匀。在37℃水浴4h。（2）电泳，在紫外观察分析仪上观察酶切结果。4.2目的基因的获得和重组载体的构建1)实验试剂：模板DNA；dNTP；TaqDNA聚合酶；引物；10×buffer（内含Mg2+）；ddH2O；10×T4DNA连接酶buffer；T4DNA连接酶。2)实验步骤：目的基因的获得、检测及回收（1）依次混匀下列试剂：反应体系ddH2O9.5μlMix12.5μl上游引物1μl下游引物1μl模板1μl混合后瞬时离心。（2）PCR反应程序94℃预变性3min94℃变性30sec52℃退火30sec30个循环72℃延伸1min72℃延伸1min4℃（3）电泳：扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。（4）用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下来，称取重量。（5）以0.1g凝胶对应300μl的体积加入PN。（6）50℃水浴10min，期间不断温和上下翻动离心管至胶完全溶解。（7）将上一步的到的溶液加入到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管中，13000rpm离心60s，弃掉废液。（8）加入800μl漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉废液。（9）加入500μl漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉废液。（10）将离心吸附柱放回收集管，13000rpm离心2min。（11）取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适量洗脱缓冲液EB30μl，洗脱缓冲液在65℃水浴中预热，室温放置2min，13000rpm离心1min，然后将离心的溶液重新加回到离心吸附柱中，13000rpm离心1min。（12）电泳检测回收产物，余置于-20℃保存。重组质粒的连接将PCR扩增的目的基因片段产物与PGM-T载体连接。反应体系（μl）如下；体系成分体积（μl）溶液Ⅰ5PGM-T载体0.2目的基因产物4.8将反应液混合，16℃30min。4.3感受态细胞的制备及转化1)实验试剂:LB培养液；0.1mol/LCaCl2溶液；E.coliDH5α受体菌（R-M-）；LB培养基；氨苄青霉素；IPTG；X-gal。2)实验步骤感受态细胞的制备（1）活化E.coliDH5α菌株：将实验室保存的E.coliDH5α菌株甘油管用无菌去离子水1:100稀释后，平板划线法接种在无抗生素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，见有菌落长出，用接种环从平板上挑取一个单菌落，接种到20ml无抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜。（2）按照1%接种量，从上述培养液中吸取菌液2ml，转接入200ml新鲜的无抗生素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡继续培养至OD400值为0.3-0.5左右。（3）在已灭菌的10ml离心管总吸取上述培养液10ml，冰浴20min后，4℃、6000rpm离心10min，收集菌丝，弃上清。（4）加2ml冰预冷的0.1mol/LCaCl2溶液，重悬菌体，冰浴10min。4℃、6000rpm离心10min，收集菌丝，弃上清。（5）将每一份沉淀轻缓的悬于0.4ml冰预冷的0.1mol/LCaCl2溶液中，轻轻重悬菌体沉淀。冰上放置10min。（6）分装100μl/管（冰浴分装），置-4℃冰箱保存。连接产物转化感受态细胞（1）转化用固体LB培养基平板的制备向含有100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的固体LB培养基平板上加50mg/ml的IPTG16μl和20mg/ml的X-gal40μl，用灭菌涂布棒涂布均匀，37℃避光倒置3h，让溶解X-gal的二甲基酰胺尽量挥发干净。加入IPTG和X-gal的转化用平板应避光保存，以防试剂见光分解。（2）连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞①去5μl连接产物加到100μlE.coliDH5α感受态细胞（从-70℃冰箱取出放于冰上，带钢解冻加入连接产物）中，轻弹混匀，冰浴20min。②取出离心管，42℃水浴热击90s，立即置冰浴中冷却3min。③向离心管中加入900μl37℃预热的无抗生素的LB液体培养基，混匀后，37℃、200rpm振荡培养1h，复苏菌体。④取出离心管，6000rpm离心2min，弃上清800μl，用剩余的月100μl上清液将沉淀菌体吹打混匀后，加到含100μl/ml氨苄青霉素（Amp）的IPTG和X-gal的LB固体培养基平板上，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀。放在室温直至液体吸收。倒置平板，37℃恒温培养14-16h，直至长出单菌落。4.4重组子的筛选鉴定1)实验试剂：dNTP；Taq聚合酶；引物；10×buffer（内含Mg2+）；ddH2O；NdeⅠ；XhoⅠ；Apm；LB培养基2)实验步骤重组质粒的PCR鉴定（1）挑取单菌落：使用无菌枪头挑取5个白色单菌落，放入内含有氨苄抗生素的LB液体培养基的1.5ml离心管中，振荡培养4h以上，吸取0.5μl菌液作为PCR反应模板，其余继续培养。（2）PCR反应体系（10μl）ddH2O9.5μlMix12.5μl上游引物1μl下游引物1μl模板1μl混匀后瞬时离心。（3）PCR反应程序94℃预变性3min94℃变性30sec52℃退火30sec30个循环72℃延伸1min72℃延伸1min4℃（4）电泳：扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳。重组质粒的酶切鉴定（1）挑取上述经菌液PCR鉴定为阳性的菌落，接种到20ml含60μg/mlApm的LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床培养过夜。（2）质粒DNA的提取（碱裂解法），加50-100μlTE（内含50μl/ml的RNAaseA）溶解DNA，37℃放置30min，消化RNA。（3）双酶切鉴定体系：用限制性内切核酸酶对PCR阳性菌落提取的质粒做双酶切鉴定。酶切体系（20μl）体系成分体积质粒5μlXhoⅠ(10U/μl)0.5μlNdeⅠ（10U/μl）0.5μl10×buffer3.0μlddH2O11μl4.5目的基因在原核细胞中的表达1)实验试剂：LB培养基；kan；IPTG。2)实验步骤（1）重组质粒的转化：将重组质粒转化表达宿主菌E.coilBL（2）重组质粒的鉴定（3）重组质粒的诱导表达五.实验结果与分析实验一：质粒DNA的提取和酶切电泳鉴定实验结果：当时实验时，有两个是只加氯仿，还有两个是按实验步骤操作的，结果只有两条明显的条带.如图2所示。有条带的是1、4管没有条带的是2、3管实验分析①在实验过程中，试剂添加失误或试剂配制不成功。导致未提出纯化DNA。②杂质没有去除干净，DNA没有完全提纯③加入酚/氯仿没有被异戊醇/氯仿中和完全，导致那两个失败。实验二：目的基因的获得和重组载体的构建实验结果跑胶结果：与maker比较得bpDNA胶重：3g电泳检测结果：与目的基因大小一致实验三：大肠杆菌感受态的制备和连接产物转化感受态细胞实验结果：失败，没有筛选出蓝白斑实验分析：①在实验过程中，操作不严谨，不够细心②小组成员在无菌操作时其他组员在旁边说话