常见细胞实验流程

实验前准备根据自己实验的情况提前预定超净台进入细胞室之前必须穿鞋套，戴手套将实验所需要的实验仪器放入超净台内紫外照射灭菌15-20min高压灭菌操作1.将所需灭菌的枪头，EP管等仪器放入枪头盒或饭盒中，并用报纸将枪头盒包好。2.将仪器放入灭菌锅之前，首先要检测一下锅内的水位是否超过锅底的圆圈，若没有超过则需加水。3.检测水位之后，将包好的器材放入锅内，盖上锅盖并拧紧螺丝。4.插上电源，先将电压调至250V，目的在于排尽锅内的空气，（当排气阀有白气冒出时，说明空气已排尽）空气排尽后，关闭排气阀。5.关闭排气阀后指针上升，当指针竖直时，将电压调至125V，保持锅内压力的稳定。6.开始计时，灭菌30min。结束时关闭电源，等至指针慢慢降下即可。7.拿出锅内的器材放入恒温烘箱中烘干，2天后即可拿出。（组织内）蛋白质提取过程1.对癌组织和癌旁正常组织进行称重，记录数值。2.根据RIPA裂解液Ⅲ说明书（每100mg组织中加入1ml溶液A，1ul溶液B，5ul溶液C）按照组织块得大小配好ABC混合液。3.将组织块加入匀浆器中，并加入相应量得ABC混合液，冰上静置5-10min，开始研磨。4.将研磨好的组织液倒入事先准备好的EP管中，12000rpm/5min.5.离心结束后，收集上清液，弃去沉淀，上清即为所要的蛋白。蛋白质浓度测定1、取96孔板冲洗干净后超声处理30min,之后用去离子水冲洗干净烘干即可2、配制BCA标准蛋白液：浓度原液体积去离子水体积A管：2000ug/ul30ul0ulB管：1500ug/ul37.5ul12.5ulC管：1000ug/ul25ul25ulD管：750ug/ul18.75ul31.25ulE管：500ug/ul12.5ul37.5ulF管：125ug/ul3.125ul46.875ulG管：25ug/ul0.625ul49.375ulH管：00ul50ul取8个EP管，分别标上以上字母，并按上表加入相应的原液蛋白和去离子水先向96孔板内加入200ul的绿色底物溶液（根据实验计算所需要用孔的个数加入底物液）加完后，将配好的A,B,C,D,E,F,G,H标准液10ul按照96孔板上第1列上的字母标记依次加入之后在其他的孔内加入10ul蛋白样品（每个样品应重复2次）加好样品后取保鲜膜将96孔板封闭好，以防止蛋白浓度发生变化，之后将板放入保温箱中静置30min30min后将96孔板拿出放入测量仪器内（应按照仪器使用说明进行操作）数据测完后另建文件夹，保存数据，之后插入尤盘拷取数据在获得的数据结果中，根据BCA的标准蛋白浓度梯度值和560nm下对应的OD值计算可得出一个OD值与浓度相关的标准曲线：y=ax+b（计算机上操作）将测得的蛋白样品的OD值带入公式，即可求出蛋白样品的浓度若实验有实验组和对照组，应将两组的蛋白浓度标准化，即是两组的蛋白浓度相同（相同浓度下的两组实验才具可比性）将浓度标准化的样品蛋白与loadingbuffer混匀至100ul（混合液中loadingbuffer应为1X的，但实验室的一般为5X），稀释方法：取20ul5Xloadingbuffer+80ul样品蛋白混匀即可在加样做westernblot之前，蛋白样品需变性：将与loadingbuffer混匀好的蛋白样品放入100度金属浴内高温变性10min（EP管上要加帽以防止温度过高EP管盖会冲开）（组织内）RNA提取过程1.将组织放入匀浆器中，加入1ml的Trizol，冰上静置10min，进行研磨。2.将匀浆好的上清转移至1.5mlEP管中，进行离心12000rpm/5min.3.离心后收集上清液于新的EP管中，加入200ul氯仿，剧烈摇匀后静置5min，然后12000rpm/5min.4.离心后取上清于另一新的EP管中，取液时不要取到中间层的蛋白。之后按1:1的比例加入异丙醇，摇匀后静置15min，进行离心12000rpm/10min。5.离心后倒掉上清（可看到白色RNA沉淀），加入1ml75%乙醇DEPC水溶液温和震荡，悬浮沉淀，3000rpm/5min.6.倒掉上清，在滤纸上空干。然后加入20ulDEPC水溶解沉淀，并吹打均匀。（如果RNA量较多，可相应的加更多的DEPC水，40ul甚至60ul）7.测定RNA浓度，取1ulRNA+99ulDEPC水于EP管中（相当于稀释100倍），另取一EP管放100ul的DEPC水用于定标。定标后倒掉，用去离子水冲洗比色皿，然后测定RNAOD值和浓度，记下数据。8.RNA电泳（用于检测提取的RNA是否已降解）配胶(1%的胶)：取0.2g琼脂糖+20mlTAE+1ulEB制胶时，应让液体沸腾3次，冷却后加入EB混匀（每20ml加1ulEB）,胶制好后倒入板中凝固，并垂直地插入梳子，静置30min后拔下梳子（可提前用梳子划动下胶，使得胶更均匀）。取1ul的Loadingbuffer和样本RNA混匀，加样正确的电泳结果应有3条带：28S、18S、5S。28S亮度应为18S亮度的2倍，5S条带越宽越代表RNA降解越多。如果加样孔内有残留代表蛋白污染，如果离加样孔很近的地方有条带代表DNA污染。细胞冻存首先向培养瓶内加入胰酶（1ml）消化细胞显微镜下观察细胞形态，当细胞变圆脱落时，即可用适量培养基中止消化，之后将细胞液吸入15ml的管内（动作要快，防止胰酶损害细胞）将管内1/3的细胞液放回培养瓶继续培养（剩余的细胞液平均冻存两管）离心剩余的细胞液，1200rpm,5min（用等量的PBS配平）离心后弃上清，得白色沉淀。可在试管台上轻轻来回划动试管，使得沉淀松动更易于悬浮用配好的3ml冻存液悬浮沉淀，吹打混匀，使得细胞为单个细胞分别取1.5ml放入两冻存管内，在冻存管上做好标记：细胞类型，代数，日期等标记好后4°冰箱放置30min（切勿超过30min），计时之后-20°冰箱中放置30min最后放入-80°冰箱内可保存半年。若半年后还没有使用则需要将细胞拿出来复苏，长满后再冻存起来。冻存液的配制方法：血清（20%）+DMSO（10%，超净台上锡纸包裹的）+培养基（70%）例如配3ml冻存液：血清=600ul；DMSO=300ul；培养基=2100ul细胞复苏将实验所需要的仪器提前放入超净台内紫外灭菌15-20min在整个复苏过程中冻存的细胞都应保持在37°水浴中烧杯中放入37°水，将从冰箱内拿出的细胞用镊子夹住放入烧杯内摇晃使细胞慢慢融化细胞融化后，用酒精浸湿的纸擦干冻存管之后在超净台内将细胞液吸取到放有适量（例10ml）PBS的15ml管内吹打均匀（在取细胞之前提前在管内倒入PBS）1200rpm，5min离心，离心后弃上清得沉淀将得到的细胞沉淀用适量的培养基悬浮，并吹打均匀，使细胞单个存在吹打均匀后，用吸管将细胞液吸入培养瓶中（大/小培养瓶根据自己的实验而定）最后向培养瓶内加入适量的培养基显微镜下观察细胞情况最后将培养瓶盖子拧松，放入37°培养箱培养WesternBlottingWesternblot实验过程中所需要配制的试剂:1XTBST:（用于洗膜）100ml10XTBS+900ml去离子水+1mlTween205%牛奶：取5g牛奶溶于1000ml1XTBST中混匀1XRunning:（用于跑电泳）10XRunning100ml溶于900ml去离子水中1Xtransfer:（用于转膜）10XTransfer100ml+100ml无水甲醇+800ml去离子水一抗：用5%牛奶将一抗稀释2000倍（稀释倍数根据自己实验而定），若抗体由甘油保存，稀释一抗应取所计算体积的2倍。二抗：用5%牛奶将二抗稀释10000倍（牛奶封闭性更好）具体操作流程：1.清洗玻璃板一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都要洗净，之后先用自来水冲洗干净，再用去离子水冲洗干净，立在桌面上晾干。2.配胶（区别于RNA电泳胶）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。先按照10%Gel（10ml）比例配下层的分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃缓慢放出，待胶面升到绿带中间线高度即可，然后加入100ml异丙醇封闭静置等待胶凝固，（若试管内剩余的胶凝固代表玻璃板内的胶已经凝固了）凝固后倒掉异丙醇，用去离子水冲洗干净，并用吸水纸将水吸干，并避免刮破胶再按照5ml的比例配上层的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀后即可灌胶。将配好的胶灌满剩余的空间，之后垂直缓慢地将梳子插入浓缩胶中，避免产生气泡胶凝固后即配胶结束配胶注意事项：若配好的胶不立即使用，可以保存在4度冰箱内，但保存时间不宜过长（用卫生纸包裹玻璃板，浸湿卫生纸，放入一次性塑料手套内即可，此时不要拔下梳子）蛋白胶分为两层，上层为浓缩胶，下层为分离胶。按照10%Gel的方法进行配胶。注意：选择玻璃板时要看清玻璃板上的大小标记，一般用10ml的。玻璃板一定要用去离子水洗干净，之后室温晾干。浓缩胶和分离胶配制所用Tris-Hcl的PH值是不同的，分别为7.8和6.83.跑电泳与上样配制（1000ml）1XRunning电泳缓冲液：（实验室现有的是10X）取100ml10XRunning缓冲液溶于900ml去离子水中即可得到1XRunning缓冲液将配好的胶板放在电泳槽内，注意正负电极的准确连接，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出倒入配好的电泳缓冲液，若使用的是两块胶，加入的电泳液液面应超过“2Gel”字符线（电泳液也要灌满玻璃板）加蛋白上样量：测完蛋白含量后，计算含20-50ug蛋白（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）的溶液体积即为上样量。用10ul枪头进行加样，将枪头插入加样孔缓慢加入样品，加样过快的话容易使样品冲出加样孔（注意同一实验和对照组所加的上样量应该相等，这样才具有可比性），同时加入2-3ulMarker作为条带分子量大小的对照加样完毕后，盖上电泳槽盖，连接电源，先调电压至120V，按start开始跑电泳当样品被压成同一水平的线时，可以降低电压至100V或80V左右，电泳至样品内的溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，关闭电源，进行转膜4.转膜转膜前先用镊子捏住两张硝酸纤维素膜的一边浸泡在无水甲醇中配制1Xtransfer（转膜缓冲液）：取10xtransfer100ml+100ml无水甲醇+100ml去离子水混匀即可将转膜液倒入搪瓷盘内，并放入转膜所需的夹子（夹子具有黑白两面）、两块海绵垫（海面上带有滤纸）、小绿板和浸过的膜将夹子打开使黑的一面位于底部保持水平，在其上垫一张海绵垫，用小绿板来回擀几次排除其内的气泡。要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，除去小玻璃板后，将浓缩胶用小绿板轻轻刮取，要避免不要把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用小绿板擀去气泡。之后将另一海绵垫平铺在胶上，用手压住，并用小绿板赶走气泡，注意动作要轻柔，避免胶与膜发生错位。气泡赶净后就可以合起夹子（整个过程都要在转膜液中进行）。另外一块胶按照形同的过程进行操作之后将夹子放入转移槽中，要使黑色的面对槽的黑面，夹子的白面对槽的红面。由于在转膜的过程中会产生热量，所以将整个转膜槽放入装有冰块的桶内进行。插上电源，调电压至80V，转膜2h（转膜时电极方向注意是膜正胶负）转膜结束后，可看到膜上有明显的Marker条带，用丽春红染色液让膜显色，之后可以看到膜上蛋白的条带将膜放入一平皿内于摇床上脱色，放入1xTBST洗三次，每次10min。若事先知道目的蛋白的分子量，可以用保鲜膜将膜包裹，之后将膜修剪脱色之后，用牛奶对膜过夜封闭或封闭1h（4度冰箱内的摇床上过夜）封闭后，用TBST洗3次，每次10min加一抗2h（若牛奶封闭1h,可以加一抗过夜）用1xTBST洗3次，每次10min加二抗，封闭1h用1xTBST洗3次，每次10min5、