激光共聚焦操作步骤

激光共聚焦操作步骤1.细胞爬片洗3遍PBS，洗的时候不要太冲，加PBS稍微晃一下就可倒掉，可不用等3~5min。2.4%预冷的多聚甲醛固定20min，PBS洗3遍。3.0.2%TritonX-100通透10min，PBS洗3遍。4.与二抗相同宿主的血清（一般是BSA）封闭30min，PBS洗3遍。5.一抗4℃湿盒过夜（一般在六孔板周围加点PBS即可），也可37℃、2h，但前者好一些，PBS洗3遍。6.二抗37℃，2h（避光），PBS洗3遍。7.DAPI染核（3~5min即可），PBS洗3遍，用滤纸小心的吸去多余的水分。8.滴一小滴抗荧光淬灭剂于载玻片上，把盖玻片轻轻的挑出来盖在抗荧光淬灭剂上（注意尽量不要有气泡）然后用指甲油滴在盖玻片的四周（为了固定盖玻片）。注意事项：1．细胞不要满，能清楚看到细胞形态即可，各位老师同学在做的时候，一般24小时左右看一下细胞的状态，不要长满了。2．二抗在用之前一定要离心，不然会有很多荧光碎片。3．在加二抗和DAPI的过程中注意避光。4．染完后如果没加抗荧光淬灭剂要尽快照，因为荧光会淬灭。加了抗荧光淬灭剂，荧光片子要避光保存，保存好的过段时候还能照。