CRISPR技术历史与应用

新一代基因编辑技术CRISPR/Cas9基因组定点编辑技术回顾疾病模型药物开发基因治疗基因组编辑定义基因组编辑（GenomeEditor）:指对基因组进行定点修饰的技术。利用该技术可以精确定位到基因组的某一点上，对靶标DNA进行精确切割，并插入目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、敲入等。基因组编辑基本原理特异高效的产生DSBZFN与TALEN技术锌指核酸酶技术转录激活样效应因子核酸酶CRISPR研究主要事件时间轴1987年…E.coliK12的碱性磷酸酶基因大阪大学29nt的短回文重复序列规律间隔长32nt的非重复序列间隔重复序列1993年西班牙阿利坎特大学FranciscoMojica大肠杆菌地中海嗜盐菌间隔重复序列重要功能地中海嗜盐菌2000年成簇规律性间隔短回文重复(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeat,CRISPR)荷兰乌得勒支大学扬森（RuudJansen）CRISPR相关基因（CRISPR-associatedgenes,cas1tocas4）解旋酶外切酶CRISPR化脓性链球菌2002年正式命名CRISPR不同物种间高度保守CRISPR同一物种间高度保守Cas基因DNA修复基因调控复制分区CRISPRCRISPR功能假说生物信息学2003年CRISPR与噬菌体同源西班牙阿利坎特大学Mojica法国农业研究院AlexanderBolotin法国国防部GilesVergnaudBLAST间隔序列与噬菌体高度同源参与细菌适应性免疫机制CRISPR适应性免疫的两种假说类似RNAi机制引导Cas蛋白切割病毒DNA谜团逐渐解开-从嗜热链球菌说起（2007年）Cas9CRISPRRepeatSpacerCas7IntegrationViralDNA遗传筛选首次证实CRISPR发挥适应性免疫功能ACas9负责外源DNA的切割BCas7产生新的间隔和重复CDANISCO发现crRNA和tracrRNACas9Pre-crRNARNaseIIICas9tracrRNACas9-crRNA-tracrRNAcomplexcrRNAmaturation2008年CRISPRRNA（crRNA）2011年trans-activatingCRISPRRNA(tracrRNA)切割双链DNA的必要条件切割病毒双链DNA引导Cas9蛋白靶向病毒DNAcrRNA连接cas9与crRNA促进crRNA成熟tracrRNA为何cas9不会切割CRISPR基因座Cas9原间隔序列比邻模序(PAM)ProtospacerAdjacentMotifCRISPR原间隔序列HNHRuvCsingleguideRNA(sgRNA)2012年捅破窗户纸，开启新时代Cas9晶体结构sgRNA为构造普遍可设计的RNA引导的DNA核酸内切酶铺平了道路。开辟真核细胞新战场010203优化密码子guideRNA核定位序列(NLS)高表达进入细胞核引导Cas9CRISPR-Cas9技术优化ZhangFeng嗜热链球菌Cas9蛋白效率低下化脓链球菌Cas9蛋白（spCas9）脱靶效应（off-targeteffect）Cas9nickase（Cas9n）2条配对sgRNACRISPR破茧成蝶CRISPR-Cas9技术运用拓展原间隔序列的3’端存在PAMcrRNA与原间隔序列互补要点总结基因组编辑原理1细菌适应性免疫机理2Cas9-crRNA-tracrRNAcomplex3Cas系统的靶向切割要求4外源DNACRISPRCas蛋白切割整合crRNA切割DSB非同源末端连接同源定向修复真核细胞应用改造5Cas9切割DNAcrRNAtracrRNA与DNA配对连接cas9和crRNA0102优化密码子核定位序列sgRNAtracrRNACRISPRCRISPR的启迪弄清楚耐盐细菌内奇怪的重复序列防范生物战争提高酸奶产量JenniferA.DoudnaZhangfengGeorgeM.ChurchEmmanuelleCharpentier医学突破来源于意想不到的地方个人兴趣军事需要工业应用大数据“无假设驱动式”发现科学突破鲜有灵感迸发的瞬间FranciscoMojica感谢各位专家的聆听汇报人:2016年6月23日为何CRISPR/Cas系统不会对自身模版产生剪切？PAM