细胞培养概述

第一章细胞培养概述主讲:况海斌Ph.D南昌大学医学院生理学教研室计划生育生殖内分泌研究室[e-mail]课程安排:第一次：细胞培养发展史（略讲）、细胞培养室的设计（重点理解其原理，从而达到对细胞培养室要求的理解，如进出培养间要关好每一扇门）。实验器械清洗、包装和清毒（清洗要领、清洗液的配配制和使用的期限、包装的具体步骤：如何包装培养瓶，清毒的方式、压力与时间。第二次：实验室常用仪器、设备的使用与维护：净化台（使用的区域、物品的摆放、操作方式、消毒、秽物处理）；自动双重纯化水蒸馏器（使用与注意事项）；培养液的过滤器（简单与自动抽气泵的过滤器使用介绍、操作关键点）；清毒器（种类、消毒时间、压力、和注意事项），CO2培养箱（使用及注意事项）；干燥箱；液氮生物容器；冰箱；显微镜；倒置显微镜；荧光显微镜；天平；酸度计；电泳仪；PCR仪；离心机；振荡器，摇菌摇床等相关设备。第三次：细胞培养用液及培养液（基）：水的要求；平衡盐溶液（种类与配制）；消化液（种类与配制）；谷氨酰胺补充液；抗生素溶液的配制；培养基颜色要求与变化代表的意义；小牛血清的批号、灭活与分装；天然培养基；常见合成培养基种类、如何配制、分装与贮存。第四次：细胞培养的基本技术：原代细胞分离（培养前准备、无菌操作的注意事项具体的流程）、培养（酶消化法和组织块培养法、如何计数、接种密度）。细胞生长状况的观察（培养液颜色与透明度的变化、细胞生长状况、细胞形态变化、微生物污染、体外培养细胞的生长类型、细胞培养中的常用术语）；培养细胞一代生长过程（分期及特点）；盖玻片条细胞培养法；细胞传代（消化酶、传代的比例、及注意事项）；冻存与复苏（冻存和复苏的原则：慢冻快融；冻存和复苏具体操流程）。细胞培养注意事项（如细胞污染判断、观察与处理原则）。第五次：细胞培养的研究方法：活力的检测（死、活细胞鉴别；凋亡细胞检测）；细胞增殖实验（MTT法、MTS法以及BrdU法）；细胞和细胞器分离与培养（速度、等密度、流式细胞分离技术）；细胞形态学研究方法（细胞固定、常用染色法、细胞免疫组化，免疫荧光法）；细胞克隆技术（细胞克隆形成试验）。第六次：具体原代细胞的分离与培养流程及实验设计（如心肌分离与培养、从作者论文来分析论文设计及实验操作关键过程）。第七次：干细胞的分离与培养流程、及实验设计（使学生了解长期细胞培养流程、注意事项、以及干细胞诱导分化过程、鉴定的流程和相关的指标）。第八次：细胞转染技术（质粒序列选择、酶切位点选择及引物设计、如何连接、接种，挑选阳性菌进行PCR扩增和测序，以及产物鉴定。磷酸钙共沉淀法基因转染、脂质体转染法。了解病毒转染法和RNA干扰技术。）第九次：胚胎技术：（常用的昆明白小鼠超排卵方法及胚胎收集程序、小鼠胚胎培养步骤、小鼠胚胎与小鼠子宫上皮共培养步骤、小鼠子宫内膜上皮和基质细胞的分离培养、小鼠外胎盘锥的培养、外胎盘锥与蜕膜细胞的共培养、人绒毛的分离与培养、胚胎移植技术、显微操作技术）第十次：参观与讨论：主要参考书：1.《动物细胞培养技术》作者：程宝鸾，出版社：中山大学出版社2．《细胞培养》作者：司徒镇强，吴军正出版社：世界图书出版公司3.《小鼠发育生物学与胚胎实验方法》作者：金岩出版社：人民卫生出版社4.《小鼠胚胎操作实验手册》作者：安德拉斯.纳吉翻译:孙青原主要内容:一、细胞培养发展史（略讲）:二、细胞培养室的设计（重点理解其原理）:三、细胞培养实验室无菌的基本要求:四、如何准备一次实验(实验器械清洗、包装和清毒):一、组织培养发展简史（一）发展史1878ClaudeBernard:证明一个器官在个体死亡以后仍然可以人工维持。1885WilhelmRoux:首次采用了“Tissueculture”这个名词。1887RossHarrison:利用的青蛙淋巴液作为培养基，在体外培养青蛙神经嵴，维持其活性达数星期，并观察到了RossHarrison被称为细胞培养之父。RossHarrison早期培养1898年Ljunggren将人体皮肤保存在腹水中几天至几周后再移植手术获得成功。1903年Jolly用玻片悬滴法培养蜂螺白细胞存活近一个月1906年Beebe等用动物血清培养狗的传染性淋巴瘤细胞达72小时。1910Burrows:率先在血浆凝块中长期培养鸡胚细胞.培养器材：Harrison（1906）通过采用单盖片悬滴培养法,用淋巴液培养蛙胚神经组织数周，从此标志着体外培养组织细胞的基本模式的建立。Carrel（1923）设计了卡氏培养瓶，进一步研究细胞的营养问题。Strengeway（1926）设计了表玻璃培养法，为研究动物器官在体外的发育与功能作出贡献。以及现在培养瓶、培养板和培养皿的发展。组织培养发展示意图1948Fisher:研制成了第一个化学成分清楚的细胞培养液CMRL1006，该培养液至今还在使用。1951年Eagle开发了能促进动物细胞体外培养的人工合成培养基。1952Gey和同事：分离培养了Hela细胞。1952Dulbecco:发明了噬斑法，用长满的单层细胞检测病毒。培养基（液）：1955年Dulbecco发明了用胰蛋白酶消化分离组织细胞的方法，建立了单层细胞培养技术。1961Hatflick&Moorhead:显示人成纤维细胞在一定的代数之后会死亡。1965Ham:配制了第一个无血清培养液。1975Kohler&Miltein:成功的得到了第一个用于单抗生产的杂交瘤细胞株。（二）我国组织、细胞培养的发展：20世纪30年代传入我国。20世纪50年代起步。20世纪70年代，成为医学和生物学研究中普遍应用的手段。（三）细胞培养的优点：1、活细胞：能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动。2、可控制：选择对象：均一性、重复性（类型、性质、阶段）调节条件：各种因素（物理、化学、生物等因素）利用方法：研究技术、记录方法3、应用广：领域多：医学研究、生物技术、基因工程等对象广：各种动物（低等动物--高等动物--人类）一种动物（不同年龄、不同组织）正常或异常（肿瘤）4、较经济：可提供大量、同时、重复性好的、生物学性状相似的实验对象。（四）细胞培养的缺点：人工模拟的培养环境与体内相比仍然存在一定差异，培养的细胞或组织，其形态或功能会发生不同程度的改变。与体内主要不同相对孤立、相对单一、缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响。主要表现失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱、细胞趋向单一化。提示要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。二、细胞培养室的设计（一）细胞培养的必备设施无菌实验室超净工作台恒温培养箱其他设备（电热干燥箱、冰箱、水纯化装置、普通光学显微镜、倒置显微镜、细胞液氮储存器、离心机、恒温水域锅、消毒器、抽滤装置等）1、无菌实验室：设计原则：防治微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘。1、无菌实验室：总的要求：抽风过滤系统无菌实验室：组成：更衣间：放在外，供更换衣帽、鞋子等之用。缓冲间：位于更衣间与操作间之间，也可同时与几个操作间相通。操作间：放在内间，供无菌操作和细胞培养，房间不受日光直射，大小适宜，高2.5m。2、超净工作台：超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。其它老师专门讲述实验室仪器：恒温培养箱其他设备（电热干燥箱、冰箱、水纯化装置、普通光学显微镜、倒置显微镜、细胞液氮储存器、离心机、恒温水域锅、消毒器、抽滤装置等）3、如何维护无菌环境：保持无菌的基本要求：（1）实验前准备：分门别类制定操作卡片，实验前按卡片收集、清点、清洗及消毒所需物品，一并放入无菌操作台内，实验器材准备数要大于使用数，瓶盖数要大于瓶数。（2）无菌室及操作野消毒实验前无菌室及无菌操作台(超净台)以紫外灯照射30分钟灭菌，打开抽风系统，抽风大约20分钟，进入培养室。以70%ethanol擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。(3)无菌操作要求无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。(3)无菌操作要求：小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验.容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的火焰前方进行,瓶口、吸管、注射器使用前要经过火焰消毒后使用。试剂用后立即封闭瓶口。专管专用，勤换吸管。瓶口液滴不能倒回瓶内，液滴用干酒精棉球擦拭，瓶口再经火焰消毒。盖瓶时瓶口和瓶盖经火焰消毒。(4)实验后要求实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面（一般先用加入新洁而灭或84的液体清洗）。关闭超净台灯、风和电源。未使用过的器材放入饭盒中，用过的器材清水浸泡。(5)整个实验室的日常维持：实验室维持：实验室的日常维持是动物细胞工程实验室所必须进行的。在实验室工作的每一位研究人员都应该被安排在一定范围内承担实验室维持工作任务，以便使实验室保持在一个好的工作状态和工作秩序。(5)实验室日维持任务——废物容器和废液体应带出细胞培养室，并在每天工作完成后将其清除。如果有培养物污染而需要废弃时，应立刻从培养室移出，并进行高压蒸汽灭菌处理。进入实验室工作的所有人员，在每天进行实验工作的前、后，用适当的消毒剂(如70%～75%酒精)擦拭工作台面。(6)实验室月维持任务——实验室月维持任务很少经常进行，但至少应该定期进行一次。如果实验室有多台培养箱连续工作，每月应有1台培养箱停止运行，进行清理和保养，拆解培养箱，对各个培养室部件进行消毒(我们半年进行一次,每月会更换孵育箱的水)。定期进行培养箱温度和CO2水平的校正，如果具有自动调零功能，至少应1年1次，最好半年进行1次自动调零。四、如何准备一次实验分门别类制定操作卡片，实验前按卡片收集、清点所需物品，进行相应清洗、包装与消毒。实验器材准备数要大于使用数（瓶盖数要大于瓶数）。（一）一般需要准备物品：1、培养瓶（培养液、消化液以及PBS）。2、离心管、吸管、盖子、TIP管、冻存管、烧杯、量筒、容量瓶、饭盒,培养皿3、枪头（TIP头）4、培养板与培养皿5、手术器械。（二）实验器材的清洗、包装和消毒细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒1、清洗在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长微生物产品附带杂物上次细胞残留物非营养成分的化学物质需要清洗的培养用品玻璃器皿的清洗胶塞的清洗塑料制品的清洗（1）玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、干燥、浸酸和冲洗等步骤清洗后的玻璃器皿干净透明无油迹不能残留任何物质浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等先用自来水简单刷洗，然后用5％稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质，再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉，用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上刷洗：用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度干燥：50-560C浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面浸泡时间：一般为过夜，不应少于6小时清洁液常用三种：重铬酸钾（