园艺-拟南芥侵染和筛选的流程

1摇菌（1）小摇：在超净工作台中取出无菌离心管，加入4ml纯净LB液体培养基，加入4ul50mg/ml浓度的卡那霉素，加入8ul10mg/ml浓度的利福霉素，加入阳性菌菌液，摇匀；在摇床中28℃培养2天；（2）大摇：在250ml三角瓶中加入150ml纯净LB液体培养基，加入150ul50mg/ml浓度的卡那霉素，加入300ul10mg/ml浓度的利福霉素，加入1.5ml菌液，过夜摇菌。2配侵染液（1）1L超纯水中加入10g蔗糖及40ul表面活性剂SilwetL-77，磁力加热搅拌器搅拌均匀；（2）大摇后的菌液用分光光度计测OD600，用离心后的上清液作为对照，菌液OD600在0.8~1.0之间时，可以进行下一步；（3）将菌液倒入50ml圆底离心管中，常温4000g离心10分钟，收集菌株；（4）倒掉上清，加入少许侵染液，用移液器把菌打散打匀，倒入侵染液中。3农杆菌花序侵染（1）托盘垫上报纸，润湿，取八盆培养良好且适合侵染的拟南芥，每盆四株；（2）将全部的花全浸到侵染液中，全部的花均需浸湿，若花无法碰到侵染液，则用戴手套的手浸湿，每盆浸湿2分钟；（3）然后将植株迅速平躺放到托盘中，用黑塑料袋盖住；（4）暗处理24小时后正常培养；（5）用于摇菌的三角瓶，侵染用的瓶子、50ml插口圆底离心管及剩下的侵染液与菌液上清均需高温高压灭菌。4收种子侵染后的拟南芥苗正常培养，30天时收取第一批种子，40天时收取第二批种子，晒干7~10天。5筛选T1代转基因阳性植株5.1选择性培养基筛选（1）将种子倒入10ml离心管中，加满拟南芥种子消毒液（0.5%SDS、0.8%NaClO），均匀打散种子，手摇振荡15分钟；（2）在超净工作台中倒掉消毒液，加满灭菌水，将种子完全打散，振荡洗涤；（3）室温3000g离心2分钟，在超净工作台中倒掉无菌水，注意不要倒掉种子，重复进行五次洗涤过程；（4）加入0.2%琼脂糖悬浮种子，用移液器均匀涂在50ug/ml卡那霉素100ug/ml头孢菌素的MS固体培养基板上，每个板3ml，晾十五分钟，等水被板吸干后再封膜；（5）暗处理春化3d；（6）将选择性培养基上长出的T1代转基因阳性植株移到土中正常培养。5.2PCR检测T1代转基因阳性植株（1）每株拟南芥选取2片茁壮的叶片放入1.5ml离心管中；（2）在离心管中研磨叶片，注意样品不能在空气中融化，注意离心管的温度并及时放入液氮中速冻；（3）每支离心管中加入500ul改良CTAB溶液，震荡使其混合均匀，静置10分钟；（4）每支离心管中加入500ul氯仿，震荡，静置10分钟；（5）室温下12000rpm离心10分钟，取上清液至另一离心管中；（6）加入等体积异丙醇混匀，置于-20℃沉淀至少30分钟；（7）室温下12000rpm离心10分钟，弃上清；（8）每支离心管中加入400ul70%乙醇，震荡洗涤沉淀，12000rpm离心5分钟，重复两次，晾干后每个离心管中加入50ul超纯水待用；（9）1%琼脂糖凝胶电泳检测；（10）DNA进行20ul体系PCR反应扩增目的基因；（11）1%琼脂糖凝胶电泳检测。5.3RT-PCR检测T1代转基因阳性植株