细胞培养技术总结

细胞培养技术总结（，，，）1·培养环境的要求（切记无菌操作）工作环境的处理1.实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%酒精擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%酒精擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。2.实验用品以70%酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。3.小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。吸管口切勿碰到容器瓶口4.工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒。感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少ClassII)。操作过程中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。2·仪器设备的要求定期检测下列项目：CO2钢瓶之CO2压力。CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000小时/HEPA)。水槽可添加消毒剂(Zephrin1:750)，定期更换水槽的水。3·无菌处理1）器具的无菌操作试验用玻璃塑料用品清洗及其消毒灭菌清洗：a玻璃器皿的清洗（酸液由重铬酸钾，浓硫酸，蒸馏水配置）浸泡—刷洗—浸酸—冲洗b胶塞的清洗刚买回的常含滑石粉等杂质，先用自来水冲洗后再按常规方法处理。2%NaoH或洗衣粉煮沸10-20分钟---1%稀Hcl浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟—晾干备用c塑料制品的清洗2%NaoH浸泡过夜—自来水冲洗--5%稀Hcl浸泡30分钟—自来水和蒸馏水冲干备用。2）消毒灭菌：a物理消毒法（紫外线，湿热，烘干，过滤）含碳酸氢钠溶液要过滤，高压会分解，培养液、平衡盐溶液及其它需要灭菌的液体：121℃,15磅,20分钟；布类、玻璃制品、金属器械等物品：先121℃,15磅,20分钟，然后在烘箱中烘干；玻璃瓶：干热灭菌170℃,4小时b化学消毒法（70%酒精，千分之一的新洁尔灭）c抗生素：培养用液灭菌或预防培养物污染3）无菌的操作技术培养物的污染及控制污染种类：（1）细菌污染：培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。（2）真菌污染：培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。（3）支原体污染：培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。（4）病毒污染：尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。（5）非同种细胞污染：污染来源：（1）不洁的动物组织标本：正常情况下组织来源是不带菌的，但由于取材不小心也会染菌，也有可能动物体本身带菌，不用浓的抗生素清洗，会导致培养污染。（2）空气：如果无菌操作区与外界隔离不严，空气中会带菌。其次，超净台使用过久，滤板堵塞也会污染。工作时不带口罩外界气流过强会污染。再者，南方空气潮湿，空气中容易带菌，操作不注意会染菌。（3）清洗消毒：培养用液除菌不彻底，培养器具清洗消毒不彻底。（4）操作不过关4试剂及器材的准备1）培养基1.液体培养基贮存于4oC冰箱，避免光照，实验进行前放在37oC水槽中温热。2.液体培养基(加血清)存放期为六个月，期间glutamine（谷氨酰胺）可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。3.粉末培养基配制(以1升为例)：3.1.细胞培养基通常须添加10%血清，因此粉末培养基之配制体积为900ml，pH为7.2-7.4。NaHCO3为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变。2）PBS：0.01M,PH=7.4的PBS配方，500ml.Na2HPO40.575g;NaH2PO40.148g;Nacl4.25g.3）胰酶：对一般细胞0.25%胰酶4）水：新鲜配制的三蒸水或去离子水5）细胞冻存液：培养基（无血清）：血清：DMSO比例7：2：1DMSO常温避光保存，不能高温高压灭菌。DMEM也不能高温高压，可以过虑除菌。6）其他：HEPES液生物缓冲液，化学性质稳定，在PH7.2~7.6范围内，比NaHCO3缓冲液的缓冲能力更强。7）培养器材：超净台、恒温培养箱、倒置显微镜、液氮储存罐、电热鼓风干燥箱、冰柜、电子天平、恒温水浴槽、离心机、压力蒸汽消毒器。a玻璃器材：无菌室培养皿、滴流瓶、刻读吸管、离心管、培养瓶、烧杯、量筒、三角烧瓶b塑料器材：多孔培养板、培养皿、培养瓶c橡皮器材：橡皮制品(最好是硅制品)做各种瓶或试管的塞子、盖子。d金属器材：剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头e其他物品：纱布、注射器和针头5.实验操作方法1)细胞复苏：冻存复苏后的状态主要与冻存保护种类、浓度、以及细胞复苏方法和复苏后培养液中小血清浓度等有关。二甲基亚砜是一种分子量小、非常强的溶解能力和非凡渗透能力的化学物质用最广泛的体外培养细胞冻存保护剂[7],其常用浓度为10%~20%，不同种属细胞的最适浓度也存在一定差别，例如，10%二甲基亚砜浓度对长期冻存K562细胞较为适宜。2）细胞传代：细胞在原代培养1~4周后，需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，影响细胞的生长繁殖。贴壁型细胞的传代：传代时需要用胰酶将细胞消化，使其从支持物上脱落，或用EDTA溶液与胰酶按1:1或1:2比例混合后联合使用。过滤除菌后，小量分装，保存与-20℃。消化时吸去培养瓶内的培养液，加入适量的EDTA溶液与胰酶的混合液，以能覆盖细胞层为度，将培养瓶平放，37℃作用3~5min，加入Hanks液，1000r/min离心5min即可除去消化液，洗1~2次后加入完全培养液，计数，置培养皿或培养瓶中培养悬浮型细胞的传代：传代时用吸管将细胞吹打均匀，特别是一些成团生长的细胞，应将细胞团块打散。根据细胞生长状况的不同，用吸管将细胞悬液吸去适当的量，然后再加入完全培养液至原体积。3）细胞冻存：传代培养的细胞,如果暂时不用,,可以冷冻保存,需要时再复苏。冷冻前一日更换半量或全量培养液，观察细胞生长状态。冷冻细胞时，所用的冷冻保存液需新鲜配制，在新鲜培养液中加入DMSO至终浓度5%-10%，加入血清至终浓度20%，混合均匀即成冷冻保存液，室温待用。将待保存的细胞离心（3000转以下3～5min）,去除上清，加入适量冷冻保存液，混匀，分装于冷冻保存管中。冷冻的方法有两种，一种是传统方法，按以下程序进行：4℃10min～-20℃30min～-80℃16～18小时或隔夜，放入液氮长期保存。另一种是程序降温法：用等速降温机以～1-3℃/min的速度由室温降至-120℃，放于液氮罐长期保存。注意事项1、实验前未检查器械和液体是否污染2、操作者未带口罩帽子，呼出空气中含细菌和支原体3、培养瓶未用75%酒精擦拭和灼烧4、操作不当吸管或培养用品接触到污染物，如皮肤，瓶壁5、操作者说话大声，来回走动，扬起灰尘。实验结果