苯酚-硫酸法测定胞外多糖含量-标准作业指导书

产品质量胞外多糖的测定1目的依据有关方法和标准，建立公司测量土壤中胞外多糖的标准方法。2适用范围本文件规定了测定胞外多糖含量的苯酚-硫酸法。本实验采用苯酚-硫酸法，该实原理是：浓硫酸水合产生的高温快速分解多糖产生单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，生成的糖醛衍生物又与苯酚反应生成橙黄色化合物，再以比色法测定本标准适用于蓝藻门、绿藻等藻类胞外多糖的测定。3参考文件无4定义胞外多糖(Exopolysaccharides,EPS)：是一些特殊微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外、易与菌体分离、分泌到环境中的水溶性多糖，属于微生物的次级代谢产物。5职责5.1测试工程师依照国家标准的更新、或者方法的改良，不定期更新本文件。5.2测试工程师应当对测试人员进行培训、考核、上岗认定和定期技能查验，对于技能不达标的人员予以相关处理。5.3测试人员应当严格依照本文件方法测定相关样品的胞外多糖含量，保证安全的情况下，认真仔细地完成实验。6程序6.1试剂和材料表1准备试剂和材料清单序号名称等级密度要求1待测藻液//2蒸馏水高纯度去离子水/3葡萄糖基准物质4浓硫酸优级纯ρ=1.84g/ml5苯酚分析纯表2混合材料和溶液配置清单序号名称浓度配置方法保存方法1葡萄糖标准溶液ρ=40μg/L（1）将葡萄糖置干燥箱于105℃干燥至恒重；（2）然后称取该葡萄糖20.0mg，溶于水，并定容于500ml的容量瓶；即为40μg/mL葡萄糖标准溶液。贮于棕色试剂瓶中保存2苯酚溶液80％取重蒸后的苯酚(分析纯)80g，加20g水溶解置于冰箱中避光储存6.2仪器设备表3仪器设备清单序号仪器设备要求备注1真空冷冻干燥机2水浴锅3离心机配50ml/10ml离心管4烘箱温度可达105℃，分辨率0.1℃。5干燥器6分析天平配具塞称量瓶7移液枪8比色管10ml/20ml9酸式滴定管最小刻度≤0.1ml25ml或50ml10分光光度计11通风橱12漩涡振荡器6.3操作流程表表4胞外多糖的测定操作流程表图示◇检查/检验□操作顺序→过程走动路线＋安全▼CC/PC▽SC/PC标记步骤步骤名称特性分级工作时间走动时间工作流程图□1试验准备SC/PC10min10min□2多糖提取CC/PC1min□3配置葡萄糖标线CC/PC2min□4多糖含量测定SC/PC30min□5计算10min□6填写试验报告1day安全要点：（1）本方法所使用的浓硫酸具有一定的腐蚀性，操作时应尽量避免直接接触；（2）苯酚具有一定的毒性，可通过呼吸道、皮肤伤害试验人员，因此尤其需要注意在通风橱配置溶液，并佩戴好必要的口罩等防护措施。反应计划：（1）每批样品应进行10%的平行样品测定，当样品在10个样品以下时，平行样品不少于1个。平行双样测量结果的相对偏差应在15%以内。（2）配置苯酚溶液时，苯酚难以从瓶中取出固体时，可使用温水浸泡。（3）由于苯酚没有重蒸纯度不足，或者比色管没有经过充分摇匀，经水浴后的具塞比色管内有时候仍存在分层现象，导致同一比色管内的溶液前后测试数值不一。因此，在测试标准曲线吸光度之前，采用旋涡振荡器摇匀后测试会有较好的效果。计算填写实验报告测定配置葡萄糖标线试验准备多糖提取6.4具体操作流程表5胞外多糖的测定具体操作步骤图示步骤名称操作要点需求试剂仪器设备1.1暂无图片安全准备（1）在进行危险操作之前，应当佩戴护目镜、口罩、手套、防护服；1.2暂无图片溶液的配置（1）按表2配置葡萄糖标准溶液，待用；（2）按表2配置80%苯酚溶液，待用；临用时配置5%苯酚溶液（80%苯酚溶液：水=1.5:18.5）见表22.1暂无图片制备冻干藻粉（1）取待测藻液若干，摇匀后倾倒至灭菌平板（或更大的器皿中），使用保鲜膜缠绕密闭封口，确保保鲜膜绷直不与藻液直接接触。然后使用镊子或其他尖锐物品，洗净后沿绷直保鲜膜平面扎出若干小孔。（2）将平板转移至冰箱中，常压低温冰冻至冰块；（3）将冻成冰块的藻液转移至真空冷冻干燥机，按操作指示操作。当一次性冻干藻液较多时，每12h要清理一次冰块。1灭菌平板2保鲜膜3镊子4冰箱5真空冷冻干燥机2.2暂无图片胞外多糖的提取（1）取m毫克（通常取100mg-200mg）冻干的样品，加蒸馏水（1：100）在98℃提取4h，5000r/min离心10min，取上清液用于分析(此处记为V1)；向离心后沉淀中加水4ml，在98℃提取1h，5000r/min离心10min，取上清液用于分析(此处记为V2)。（2）合并V1+V2，转移至25ml容量瓶，加水至标线。1冻干样品1离心机2水浴锅3容量瓶3暂无图片配置葡萄糖标线（1）用移液枪分别吸取0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、1.8mL的40μg/mL葡萄糖标准溶液放入具塞试管内，再各适量蒸馏水补足溶液至2.0mL。（2）使用漩涡振荡器将各管溶液摇匀，然后向每管依次加入1.0mL6％苯酚溶液和5.0mL浓硫酸（必须使用移液管），漩涡振荡混匀于90℃水浴加热20min。以第一管为空白对照，于490nm处测定吸值，建立葡萄糖标准曲线。1葡萄糖标准溶液2苯酚溶液3浓硫酸1移液枪2漩涡振荡器3分光光度计4.1暂无图片多糖含量测定从25ml容量瓶中取样品溶液0.2mL，加蒸馏水1.8ml补足至2.0mL，摇匀，依次加入1.0mL6％苯酚溶液和5.0mL浓硫酸（必须使用移液管），漩涡振荡混匀后于90℃水浴加热20min，于490nm处测定吸光值，得到样品浓度。1葡萄糖标准溶液2苯酚溶液3浓硫酸1移液枪2漩涡振荡器3分光光度计4.2暂无图片空白试验以葡萄糖标准曲线的0.0mL吸光值作为空白试验的参考值。5暂无图片计算多糖含量（mg/g）计算公式按下列公式计算：1000m)(2.0)(25)(2c）（gmlmlmlEPSi式中：EPS——为多糖含量，单位为mg/g；表示每1g冻干藻样中含有多糖的质量；Ci——表示各藻类的测试浓度，单位为μg/mL；2ml——表示在测试样品时，比色管加蒸馏水至2ml；ci*2ml表示，在比色管中的溶质质量；25ml——表示为采用25ml容量瓶进行定容；0.2ml——表示从25ml容量瓶中取出0.2ml进行样品测试；m——表示冻干的样品，通常取0.100g-0.200g；1000——表示由换算为单位由μg换算为mg。6暂无图片填写试验报告（1）按照附件1《实验室测试报告》格式，填写数据和计算结果。（2）总结试验结论，出具完整报告。实验室测试报告7附件附件1《实验室测试报告》