病毒性传染病实验室诊断技术进展

1分子生物学诊断技术进展张正北京大学人民医院2主要内容：分子生物学诊断技术在病原学检测中的应用简单介绍实验原理以PCR、荧光实时定量PCR、NASBA为例分子诊断技术在以下病原研究的应用进展乙型肝炎丙型肝炎结核分枝杆菌3病原学检测常用的实验室技术细胞培养与鉴定（“金标准”）、动物实验血清学、免疫学诊断技术电镜技术分子生物学诊断技术4分子生物学诊断技术方法简介1、主体技术具体方法举例循环扩增PCR（聚合酶链反应）Real-timePCR,RT-PCR，巢式PCR，复合PCRPCR-ELISA，微孔板杂交，荧光探针标记法LCR（连接酶链反应）恒温NASBA（依赖核酸序列的扩增，主要用于RNA）SDA（链置换扩增术）CPT（环状探针技术）bDNA（枝链核酸信号放大系统）杂交捕获（如：检测HPV-DNA的试剂盒）5分子诊断技术方法简介2、多标靶同时检测多重PCR毛细管电泳以测序分析为基础的检测技术6分子诊断技术方法简介3、核酸杂交DNA荧光原位杂交（FISH）将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位。线性探针分析法（LiPA）杂交保护分析法（HPA）4、质谱利用色、质谱结合PCR技术7分子诊断的功能及扩展病原的诊断和鉴别诊断病原分型病毒载量监测---个体化治疗的依据疗效及预后标志其他：病原感染中发生、发展各阶段8分子诊断的功能及扩展疾病分型及意义例如：HPV（30/100）高危---16，18，31，45低危---6，119分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗例1.---北京地坛医院谢尧提供10分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗例2.HBV---干扰素HBV100pg/mL11/30阴转HBV100pg/mL1/30阴转(HBeAgHBeAb)11分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗例3.HIV病毒载量与传播15127人流行病学调查415对伴侣30个月HIV阳转22%（90/415）51人RNA1500copies/mL全阴12分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗例4.血浆EBV载量与鼻咽癌复发15个二年持续缓解：0copy/mL10个复发：32250copies/mL17个随访：临床恶化前半年病毒载量升高13耐药病原的分子诊断WHO：人类死亡1/3是长期用药的毒副作用HBV的YMDD变异HIV耐药14血制品筛查300余万的血清阴性样品，分子生物学复测：HBV：47HCV：10HIV-1：2-2001年剑桥资料HIV-1血清阴性而RNA阳性0.2-6.6%-Am.J.ChinAthol.200015在基础研究领域中的应用；遗传病的基因诊断和产前基因诊断：如血友病、地中海贫血等肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)的检测；骨髓移植、器官移植供体配型选择；法医学、动植物学、古人类学、古生物学；与疾病相关的各种蛋白（细胞因子、酶、激素、受体）的基因表达的检测；药物基因组学、耐药基因的检测，等等分子生物学技术在其它领域的应用16简单介绍实验原理PCR(PolymeraseChainReaction,聚合酶链反应)荧光实时定量PCR（realtimePCR）NASBA（依赖核酸序列的扩增）17PCR原理:实质就是体外基因复制技术Mg2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNA聚合酶AmpErasePrimer靶序列加热变性95°C靶序列引物退火55°C引物延伸72°C18PCR循环第一步–加热变性靶序列靶序列从外周血白细胞或绒毛、羊水细胞提取的DNA约1ug，在含有适当缓冲液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等的反应混合物中，在94℃下热变性1-4分钟，使之解为单链。19PCR循环第二步–引物与靶序列退火引物与解为单链的DNA上互补序列杂交在一起，称之为退火。55℃左右20PCR循环第三步-引物延伸在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs为原料（底物），从引物的3’端A开始,沿着5’→3’的方向，合成每条模板的互补链，此称引物延伸。72℃左右21第1个PCR循环完成后2230次循环后靶序列扩增的数量No.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon23RQ探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，所以检测不到荧光，此种现象称为荧光共振能量转移。荧光PCR原理–TaqManTM技术λ245’3’RQExtensionStep5’3’1.StrandDisplacementTaqQR5’3’QTaqR5’2.Cleavage3.PolymerizationComplete5’3’TaqR5’4.Detection5’3’TaqR5’lR荧光PCR原理–TaqManTM技术25定量PCR测定的是扩增的指数扩增期;定性PCR测定的是扩增的终点（平台期）定量PCR与定性PCR测定的区别26市场上常见的实时荧光PCR仪罗氏LightcyclerMJopticon2伯乐icyclerABI7000杭州博日（原大和）linegene28NASBA扩增原理引物1逆转录酶RNaseH引物2逆转录酶T7RNA聚合酶引物2逆转录酶逆转录酶RNaseH引物1线性循环扩增循环29NASBA和PCR的不同NASBA扩增目标为RNA同温扩增连续扩增扩增物为单链RNA引物次序不包含於最终产物中PCR扩增目标为DNA温度循环扩增循环扩增扩增物为双链DNA引物次序包含於最终产物中30乙型肝炎检测标志物：HBsAg，抗-HBs,HBeAg，抗-Hbe,抗HBc(IgG,IgM),HBV-DNADane颗粒（完整的病毒）形态乙型肝炎的分子诊断31乙型肝炎的分子诊断1.重要性全球20亿人感染慢性3.5亿人中国、东南亚、非洲50％肝硬化，70-90％肝癌7-30％携带者感染变异体322.HBV基因型与血清型关系及流行病学分布基因型与血清型不完全一致临床突变率不同有地域分布特点乙型肝炎的分子诊断33表1：基因型血清学亚型基因长度(nt)临床突变率主要流行地域PC*(G1896A)BCP**(1762/1764)Aadw2ayw132216.5％（少）C185845％（常）西欧、北欧、北美、中非、印度Badw2ayw1321550％（常）T185816％东南亚、中国、日本Cayr;adrq+;Adrq-;adr;adw2321550％（常）T1858或C185858％（常）东南亚、中国、日本、澳洲、美国Dayw2;ayw3;ayw4318243%(常）T185812％（低）地中海、俄罗斯、印度、美国34表1(续）:基因型血清学亚型基因长度(nt)临床突变率主要流行地域PC*(G1896A)BCP**(1762/1764)Eayw4321227％（中）7％（低）西非Fayw4;adw2;Adw4q-321516％（少）C1858未定中美、南美、波利尼西亚GAdw23248100％（高）未定中美、美国、法国、德国Hadw43215未定未定中美、南美、美国PC**:前核心BCP**:基本核心启动子（科华生物2004.07.21）353.基因型与临床实验室表现不同（表2）病情与转归：C较B差抗病毒治疗：A优于DB优于Cadw/ayw20:1乙型肝炎的分子诊断36表2:B基因C基因HBeAg(+)少多免疫清除期短长严重急性加剧少多组织学活动性低高血清HBV-DNA水平低高PC1896突变率高低BCP双突变率低高抗病毒治疗应答好差临床转归（硬化、癌变）好差374.一般实验室分型方法测序PCR-RELP（限制性片断长度多态性）PCR核酸杂交（谱线探针法）血清学：单抗可区分A-F各基因型乙型肝炎的分子诊断385.抗病毒治疗的耐药性问题拉米夫定耐药性的检测乙型肝炎的分子诊断39拉米夫定耐药性的检测耐药性与HBV多聚酶基因YMDD氨基酸序列中的核酸变异有关I型：YMDD变异为HBV聚合酶基因(P区基因)区第741个核苷酸位,A-G置换，使第552个密码子蛋氨酸(M)被缬氨酸(V)取代，成为YVDD变异II型：YMDD变异为P基因区743个核苷酸的G-T置换，使第55个密码子蛋氨酸(M)被异亮氨酸(工)取代，成为YIDD变异YMDD变异：Y（酪氨酸）M（蛋氨酸）V（缬）：YVDD变异D（天冬氨酸）I（异亮）：YIDD变异D（天冬氨酸）最近报道：YSDD（ATGAGT）应用拉米夫定耐药位点基因芯片检测突变位点乙型肝炎的分子诊断40乙型肝炎的分子诊断41乙型肝炎的分子诊断42HCV的基因型/亚型6个型，68个亚型1a,b,c,d,e,f,g,h,i,j,k,l,m2a,b,c,d,e,f,g,h,i,k,l,m3a,b,c,d,e,f,g,h,i,k4a,c,d,e,f,g,h,k,l,m,n,o,p,q,r,s,t5a6a,b,d,f,g,h,i,j,k,l,m,n丙型肝炎的分子诊断43HCV基因分型方法•测序•型特异性引物PCR分型法•线性探针杂交（InnoLipa)•限制性片段长度多态性分析（RFLP）•TRUGENEHCV5’NCGenotypingAssay丙型肝炎的分子诊断445’UTR(5’Non-CodingRegion)高度保守HCVRNA诊断实验的常用区域有一套良好的多态性特征，因此可用于基因分型许多HCV分型商业试剂盒都采用该区进行分型TRUGENEHCV5’NCGenotypingAssayVERSANTHCVGenotypingAssay(LiPA)HCVNS5B区各亚型间基因差异较大扩增效率较低若成功扩增，序列分析可区别HCV各亚型。HCV基因分型常选用的区域丙型肝炎的分子诊断45临床工作目前常用的基因型检测方法（RFLP,InnoLipa,Trugene)通常建立在5’非编码区，因为该区序列保守，检测灵敏度高，是HCVRNA诊断实验的常用区域。在临床工作中，对5’UTR进行分型的RFLP,InnoLipa,Trugene分型都可以满足分型的需要，为制定治疗方案和判断预后提供指导。常只需将1型和4型与其它基因型相区别，以决定抗病毒治疗的疗程和利巴韦林的剂量，因此上述的任何一种方法均可以采用。丙型肝炎的分子诊断46HCV5’UTRgeneSecondPCRproduct=257bpSchemeACleavagewithBsrBⅠ,HinfⅠandHaeⅡ93and91bpGenotype2aand2b257bpGenotype3b,4aand5a127and91bp104,74bp160,74bp2a2b160,74bp234bp3b4aand5aCleavagewithHaeⅢSchemeCCleavagewithApoⅠ183,74bp257bp4a1b197bpGenotype1a,1band6a166/169and91bpCleavagewithBstUⅠSchemeB1a227bp5aGenotype3a6a257bpHCV5’非编码区ABC程序复合酶切分型法流程图-北京大学人民医院肝病研究所提供47抗HCV的确认实验确认的重要性（灰区的遗漏）目的：解决血液筛查实验（如ELISA）的非特异性问题方法：例如：•PCR–活动性病毒血症的检测是一个很好的检测方法•RIBA3.0–抗体的确认新流程：丙型肝炎的分子诊断48抗-HCV筛查检测报告阴性或根据S/Co比值判定为阳性所有阳性结果高S/Co比值阳性*报告低S/Co