临床免疫学检验-课件-第11章-固相膜免疫分析技术1

第十一章固相膜免疫分析技术（solidphasemembrane-basedimmunoassy）定义：?以微孔滤膜为固相载体?微孔膜具有多孔性，像滤纸?可被液体穿过（穿流）；也可向毛细管作用在膜上泳动(侧向横流)?标记物：酶或各种有色离子（彩色乳胶、胶体金或胶体硒）标记抗体或抗原?被检物：通过抗原抗体反应检测抗原或抗体?结果:可见的显色结果固相膜免疫分析技术固相膜免疫测定的特点优点不足之处简便，快速（10~15min）敏感度略低，价格略高（与ELISA比精密度较差，质控困难保存期长（优质试剂）稳定性较差（普通试剂）可测定物范围广（定性试验）不易制备定量、半定量试剂不需大型仪器?斑点金免疫渗滤试验(dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA)?斑点金免疫层析试验（dotimmunogoldchromatographyassay,DICA)临床上常用的固相膜免疫技术：?斑点酶免疫吸附试验(dotenzymelinkedimmunospotassay,Dot-ELISA)?免疫印迹法(immunoblottingtest,IBT)胶体金免疫技术第一节胶体金免疫技术colloidalgoldimmunoassay1.原理：以硝酸纤维素膜为载体，以胶体金作为示踪标记物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种标记免疫测定技术。2.常用胶体金免疫诊断方法斑点免疫金渗滤试验和斑点金免疫层析试验一、胶体金和免疫金的制备(p46)?定义：金盐被还原为金原子后形成的金颗粒悬液?结构：基础金核（原子Au）和双离子层?内层：负离子层AuCl2-?外层：正离子层的H+?金颗粒间因静电作用互相排斥，成稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液。（一）胶体金（colloidalgold）胶体金特性?胶体特性?呈色性和光吸收性?稳定性?聚沉现象1.胶体特性?1~100nm，微小颗粒稳定、均匀、呈单一分散状态，成胶体金溶液。?对电解质敏感：可破坏胶体金的外周水化层→胶体金凝聚成大颗粒沉淀?某些蛋白质分子可稳定胶体金2.呈色性和光吸收性随颗粒大小改变。颗粒大小不同，呈色不同：（小）2~5nm橙黄色；（中）10~20nm酒红色；（较大）30~80nm紫红色。光吸收性也不同：随着直径增大，可见光区最大吸收峰波长增长，A680/A519比值增大。肉眼观察胶体金颜色或测定其吸收峰波长的变化粗略预估胶体金直径大小胶体金颗粒（nm）胶体金特性呈色λmax（nm）16酒红色51824.5橙红色52241红色52571紫色535不同直径金颗粒的呈色性和光吸收性3.稳定性溶胶又是不稳定的体系，其溶剂化作用很弱，碰撞时有合并为较大、较重颗粒的倾向。影响因素：?胶粒间的相互吸引力：距离近，引力大导致胶体颗粒合并变大?胶粒与溶剂化层带电情况：各金胶带相同的电荷，同性电荷相斥，双电层越厚，胶粒带电量愈大，排斥力越大，越稳定。?溶剂膜斥力：金颗粒间有一层厚的溶剂化膜，反抗金颗粒接近。膜斥力越大，越稳定。4.聚沉现象?电解质：中和胶体金颗粒的电荷量，使溶剂层变薄，胶粒间排斥力减少，合并趋势增强。?温度：越高，吸附能力减弱，溶剂化程度降低，不稳定性增加?浓度：越高，粒子间距减少，引力增加（二）胶体金的制备1.制备原理（化学合成法）?氯金酸在还原剂作用下，聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电荷的疏水胶溶液。?常用还原剂：柠檬酸三钠、鞣酸、维生素C、白磷、硼氢化钠等，根据还原剂的强弱可制备直径为0.8~150nm不等的胶体金。配制0.01％HAuC14溶液，100mL搅拌，煮沸快速加入1％柠檬酸三钠，2mL煮沸15min，移除热源，继续搅拌至室温恢复至原体积。d=16nm1min内溶液由淡黄色转为灰色黑色酒红色2.常用制备方法胶体金颗粒（nm）1%柠檬酸三钠(mL)*162.0024.51.50411.00710.70胶体金粒径与柠檬酸三钠加入量的关系加入不同量的柠檬酸三钠即可得不同粒径的胶体金降低增大*100mL，0.01%氯金酸中加入的柠檬酸三钠3.鉴定和保存（1）鉴定：粒径大小、粒径均一性，有无凝集颗粒?肉眼观察：日光下观察颜色和浊度，若清亮透明即良好胶体金，若浑浊或液体表面有漂浮物提示有凝集颗粒。?分光光度计：获得最大吸收波长（见图）?透射电镜：精确测量胶体金平均粒径。测量100个以上，计算平均直径和标准差，平均直径（颗粒大小），标准差（均一性）粗略估计金纳米微粒体系的吸收光谱1.12nm;2.19nm;3.24nm;4.33nm;5.41nm金纳米球电镜照片图A：20nm；C金纳米棒：51×21nm50nm100nm王康林.纳米金共振散射相关光谱及其应用,2008优质劣质（2）保存：?洁净的玻璃容器；室温避光无灰尘环境中保存3个月，4℃保存半年?避免冻存：导致胶体金聚集。?20天内标记：胶体金的不稳定性（三）免疫金的制备(P53)1.制备原理：?原理：胶体金与抗原或抗体等大分子的结合。?实质：抗原或抗体吸附在胶体金表面。?吸附机制：不明确，可能是静电吸附作用。?胶体金表面带负电荷?蛋白质含正电荷的基团?静电吸附作用牢固结合。?优点：物理吸附，不影响蛋白质的性质。2.技术要点：（1）胶体金溶液pH的调整（吸附作用取决于pH）?接近蛋白质等电点或偏碱：低于等电点胶体金聚集失去结合能力。?用0.1mol/LK2CO3和0.1mol/LHCl维持pH?标记IgG（9.0）?标记McAb（8.2）?亲和层析抗体（7.6）?SPA（5.9~6.2）?ConA（8.0）?亲和素（9~10）（2）蛋白质的最适标记量：?方法：?标记蛋白系列稀释?各取一定量加入定量的胶体金试管中?加入NaCl，混匀后静置数小时?设置对照管：不加蛋白或加入蛋白量不够。?结果：从对照管开始溶液由蓝色逐变为红色。选维持红色管的最低蛋白含量作为稳定胶体金所必须的最适标计量NaClAuNPs蛋白质的最适标计量对照倍比稀释蛋白质混匀，静置数小时?原则：?稳定胶体金所必须的最适标计量?在最适标记量基础上增加蛋白含量10%~20%即为标记全部胶体金溶液所需的蛋白总量（3）标记过程：?在确定胶体金与蛋白的最适用比例后?磁力搅拌下，将蛋白溶液逐渐加入胶体金溶液中?数分钟后加入稳定剂（5%BSA或1%PEG20000）（4）金标记的纯化?目的：除去未标记的蛋白、未充分标记的胶体金以及标记过程中形成的聚合物。?方法：超速离心，凝胶过滤法3.注意事项：（1）pH调节：注意胶体金可阻塞pH计的电极，不可直接插入胶体金中?先用终浓度为0.1%PEG20000稳定胶体金（2）蛋白质含盐量较高或形成聚合物影响标记过程。?标记前用低浓度盐水透析数小时并高速离心除去聚合物。4.免疫金保存?用含稳定剂的缓冲液稀释成工作液保存。?缓冲液：中性PBS或Tris缓冲液?稳定剂：蛋白质、葡萄糖（最常用）、PEG20000、明胶?在免疫金中加50%甘油：-18℃可保存一年以上二、胶体金免疫技术的方法学种类与原理（p125-p127）（一）斑点金免疫层析法（dotimumunogoldchromatographicassay,DICA）1.原理?胶体金标记技术与蛋白质层析技术相结合的以硝酸纤维素膜为载体的快速的固相膜免疫分析技术。?样品借助毛细作用在层析条上泳动?与固相的抗原或抗体结合形成复合物被富集或截留?目测显色情况，判断结果胶体金标记物2.方法类型（1）双抗体夹心法-检测大分子抗原阳性：T和C处都变红色；阴性：只有C处变红色G-金标特异性抗体（兔型）A-标本T-特异性抗体（兔型）C-二抗（羊抗兔免疫球蛋白抗体）过量阳性阴性无效TC（2）竞争法-检测小分子抗原免疫层析竞争法原理示意图A-标本;G-金标抗体;T-标准抗原C-二抗（羊抗兔免疫球蛋白抗体）阴性阳性T带不变色C带都变红色T和C带变红色少量3.技术要点（1）试剂盒的组成?主要成分胶体金层析条?所用试剂全部为干试剂（2）操作要点：?加样?将试剂条标记线一端侵入待测标本中2~5s?或在标本加样处加一定量待检标本，平放?5~20min内观察结果?结果判断：因方法而异。注意无棕红色线质控带出现则试剂无效。（二）斑点金免疫渗滤试验（dotimumunogoldfiltrationassay,DIGFA）1.原理硝酸纤维素膜包被抗原或抗体洗涤液阳性：膜上呈红色斑点是床旁实验（pointofcaretest,POCT）主要方法之一，整个检测5min快速免疫反应无关成分流过渗滤装置+标本（抗体或抗原）免疫反应，浓缩胶体金+免疫金盖微孔膜吸水垫料底板斑点免疫金渗滤装置?塑料小盒?吸水垫?固相抗体或抗原的硝酸纤维素膜2.方法类型（1）双抗体夹心法：加入标本（抗原）与膜上的抗体快速结合，浓缩胶体金标记抗体，免疫反应，浓缩洗涤液洗去未结合的免疫金阳性：膜上呈红色，胶体金聚集硝酸纤维素膜上包被抗体AB固相Ab（NC膜）-待测Ag-Ab-胶体金红色洗涤液洗涤液（2）间接法：加入标本（抗体）与膜上的抗原结合，浓缩胶体金标记羊抗人IgG抗体，免疫反应洗涤液阳性：膜上呈红色（胶体金聚集）硝酸纤维素膜上包被抗原洗涤液易产生假阳性，少用。人血清标本中含有非目的IgG的干扰阳性InstantChek?HIV1+2的结果判断(图像)阴性测定无效设质控质控点大小或性状不同于检测点DIGFADICA试剂形式渗滤装置及附加试剂试剂条试剂保存4~8℃6个月室温一年操作步骤3~51观察时间5min5~20min阳性反应颜色浓度操作结束颜色不变颜色逐渐加深（三）临床应用及评价1.金免疫测定技术特点?操作简便、快捷、操作人员不需技术培训?无需仪器设备，试剂稳定、便于保存?适于“床旁检验”2.灵敏度问题不及酶标法和酶发光免疫测定法3.临床应用：定性或半定量试验?主要用于正常体液中不存在的物质?正常含量极低特殊情况下异常升高的物质（人HCG）第二节其他膜载体免疫分析技术以酶作为标记物的固相膜免疫分析技术?斑点酶免疫吸附试验?免疫印迹试验一、斑点酶吸附试验（dotenzymelinkedimmunosorbentassay,Dot-ELISA）（一）原理?原理同常规的ELISA?不同之处：载体为硝酸纤维素膜（NC）吸附蛋白能力强，取代聚苯乙烯阳性：有色沉淀物斑点酶吸附试验原理示意图洗涤洗涤包被抗原1.抗原包被膜1~2μL抗原于膜上→包被后进行封闭2.抗原抗体反应?滴加样品血清，待检抗体与膜上抗原反应?洗涤后加酶标记二抗。3.确定酶结合物最佳稀释度阴性样品不显色，阳性样品显色最强的酶结合物稀释度4.显色加底物（HRP：盐酸联苯胺）形成不溶有色物阳性：肉眼可见的染色斑点（二）技术要点优点?灵敏度高：NC吸附能力强，微量抗原吸附完全，故灵敏度比普通ELISA高6~8倍?试剂用量少：比ELISA节约10倍?实验及结果判断简单：不需仪器?试剂稳定：吸附抗原（抗体）或已有结果的膜可长期保存?可同时检测多种抗体（三）方法学评价二、免疫印迹试验（immunoblottest，IBT）（一）原理?凝胶电泳+免疫化学分析技术?又称Westernblot技术?检测蛋白质特性、表达与分布的最常用方法按分子大小分离?SDS-PAG：分离待检抗原?电转移条带至NC:100v，1~2A，通电45min?酶免疫定位:+特异性抗体；+二抗:HRP标记；显色：二氨基联苯胺（棕色）或4-氯-1-萘酚（蓝紫色）?根据SDS-PAGE时加入分子量标准确定各组分的分子量引自王少辉博士论文（二）分类?蛋白免疫印迹试验?重组免疫印迹试验?混合抗原样品单向或双向电泳分离?转印到固相载体上（NC膜，尼龙膜等），保持生物学活性不变?作为抗原检测相应抗体（如酶、发光剂）?与标记的而抗体反应（显色、发光检测）?实现对特异性抗体进行检测?如HIV抗体确认试验?利用基因重组的方法，将各种抗原表达、纯化后，包被在NC膜上，直接作为检测试剂条；?或者直接合成抗原多肽?用于病原体确认试验、复杂抗原成分的病原体分析、自身抗体的检测等?特异性较ELISA高，灵敏度稍差HIV确证试验仪器和试剂1.抗体的性质：多选多