祁自柏-体外诊断试剂的分类和基本原理

体外诊断试剂的分类和基本原理中国药品生物制品检定所祁自柏TEL：01067095386E.Mail:[e-mail]十六个体系考核类型分类表分类产品型别及产品举例（第一类）酶联免疫（酶标板、磁珠、微粒子）类试剂酶联免疫法：乙型肝炎病毒e抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）；癌胚抗原定量测定试剂盒(免疫荧光法)化学发光法：人生长激素（GH）定量测定试剂盒增强化学发光免疫分析法：巨细胞病毒抗体检测试剂盒时间分辨荧光法：游离甲状腺素（FT4）定量测定试剂盒电化学发光法：甲型肝炎病毒抗体诊断试剂盒微粒子酶免法：丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒（第二类）胶体金（硒、乳胶）类试剂胶体金法：梅毒抗体-乙肝表面抗原诊断试剂盒胶体硒法：HIV(1+2+0)试剂盒（第三类）免疫印迹试剂免疫印迹试剂盒:风湿病自身抗体检测试剂盒（免疫印迹法）（第四类）蛋白芯片（微阵列）类试剂蛋白芯片（微阵列）：丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒（蛋白芯片法）；多肿瘤标志物检测试剂盒（蛋白芯片法）（第五类）单抗类试剂血型定型类试剂：血型定型试剂盒（单克隆抗体）免疫组化：ImmuChem免疫组化试剂盒（单抗）免疫比浊：血清载脂蛋白A1免疫比浊试剂盒乳胶凝集：D-dimer二聚体乳胶凝集试剂盒（第六类）多抗类试剂血型定型类试剂：血型定型试剂盒（人血清/马血清）免疫组化：癌胚抗原检测试剂盒（多抗）免疫比浊：β-微球蛋白测定试剂盒（免疫比浊法）乳胶凝集：沙门氏菌乳胶凝集试剂盒（第七类）诊断血清（菌液）诊断血清：侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清；志贺氏菌属四种混合多价血清诊断菌液：伤寒沙门菌菌体（O）抗原、鞭毛（H）抗原诊断菌液（第八类）血球凝集类试剂抗体致敏血球：破伤风抗体诊断试剂（血凝法）；白喉抗体诊断试剂（血凝法）（第九类）核酸扩增类试剂荧光PCR：乙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒PCR-ELISA：结核分支杆菌检测试剂盒（核酸扩增酶联免疫法）PCR-毛细管电泳：性染色体多倍体（分型与突变）检测试剂盒；PCR-电泳：α-地中海贫血基因诊断试剂盒（gap-PCR法）转录介导扩增（TMA）：沙眼衣原体与结核分枝杆菌检测试剂盒第十类）基因芯片（微阵列）类试剂基因芯片（微阵列）：α-地中海贫血基因芯片诊断试剂盒PCR-杂交：人乳头瘤病毒基因分型检测试剂盒（PCR-反向杂交法）（第十一类）探针放大（原位杂交）类试剂bDNA类：HIV-1bDNA检测试剂盒；mRNA检测试剂盒(生物素原位杂交法)（第十二类）普通生化类试剂（十万级要求）（包括酶类化学试剂、凝血试剂类等试剂）酶类化学试剂:丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定试剂盒；碱性磷酸酶（ALP）测定试剂盒凝血试剂:凝血酶原时间（PT）测定试剂盒；组织纤溶酶原激活物（t-PT）测定试剂盒（第十三类）普通生化类试剂（清洁环境）（包括一般化学试剂、血气电解质类、血液分析仪用试剂类等）一般化学试剂：无机离子（铝、镉等）测定试剂盒；白蛋白测定试剂盒（BCG法）；总胆固醇测定试剂盒（COD-CE-PAP法）血气电解质:电解质分析仪随机试剂；生化分析仪用稀释液、冲洗液血液分析仪用试剂:血液分析仪用稀释液、溶血剂（第十四类）干化学类试剂干化学试剂（条、卡或盒）：干化学尿液分析试纸条；尿微量白蛋白（UALB）测试卡（第十五类）药敏类试剂药敏纸片（卡）：抗生素药敏纸片；随机专用药敏试剂（盒）（卡）（第十六类）培养基类马丁干粉培养基；人胚胎干细胞无血清培养基我国体外试剂的几个发展阶段1七十年代末，乳胶凝集，血球凝(PHA,RPHA）2八十年代初期，放射免疫测定(RIA)，抗HBs单克隆抗体3八十年代中期，酶联免疫试剂，基因工程表达乙肝病毒核心抗原和e抗原4九十年代，聚合酶链反应(PCR)，丙肝，戊肝病毒基因被克隆，各种基因工程抗原被应用5近期，发光免疫,生物芯片技术(基因芯片，蛋白芯片)（第一类）酶联免疫（酶标板、磁珠、微粒子）类试剂•酶联免疫法：乙型肝炎病毒e抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）；•癌胚抗原定量测定试剂盒(免疫荧光法)•化学发光法：人生长激素（GH）定量测定试剂盒•增强化学发光免疫分析法：巨细胞病毒抗体检测试剂盒•时间分辨荧光法：游离甲状腺素（FT4）定量测定试剂盒•电化学发光法：甲型肝炎病毒抗体诊断试剂盒•微粒子酶免法：丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒酶联免疫试剂•抗原抗体之间的特异反应与酶的高效催化反应有机的结合。固相样品放大•抗原抗体抗抗体-酶-底物-显色•抗体抗原抗体-酶-底物-显色酶标板样品中HCV抗原HRP酶标记抗HCV抗体抗HCV抗体HRP酶单克隆抗体丙肝抗原ELISA试剂HIV-1p24抗原检测试剂的原理1双抗体夹心法应用HBsAg,HBeAg,HBcAg,pres1,pres22双抗原夹心法应用抗HBs，抗HIV3竞争法应用抗HBc,抗pres24中和抑制法应用抗Hbe5捕获法应用抗HBcIgM6间接法应用抗HCV,抗HEV,几种主要的酶联免疫方法模式发光免疫试剂•1.抗原抗体反应的基本原理及方法模式与酶联免疫试剂完全相同•2.检测光信号，其光信号可因酶催化而产生也可用其他方法使其产生酶促化学发光•以酶为催化剂，通过氧化反应，使底物发光。过氧化物酶（HRP)促发光，底物——鲁米诺碱性磷酸酶(AP)促发光，底物——螺旋金刚烷环氧化物苯磷酸酯（AMPPD)鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光系统（HRP）商业化产品中常见的化学发光系统（一）ROHRBOHOHROHSN鲁米诺及其衍生物的增强剂（Enhancer）AMPPD及其衍生物的化学发光系统（AP）光子(477nm)APOOOCH3OPO32-O-OOOCH3+*OO-OOCH3商业化产品中常见的化学发光系统（二）非酶促化学发光及电化学发光•非酶促化学发光：以吖啶酯、过氧化氢为发光系统，不需要酶的催化。仪器成本高，技术复杂，尚未国产化（Abbott)•电化学发光：氧化反应是通过电极上的电化学反应产生，标记物为三氯联吡啶钌。仪器成本高，技术复杂，尚未国产化。（Roche）CH3C=OORN+OH-H+H2O2+H2O+ROH光子+CO2+CH3C=OORNHOCH3C=OORNHOOCH3ONCH3ONC=OO商业化产品中常见的化学发光系统（三）吖啶酯化学发光系统/非酶促e-TPATPATPA+H+e-e-PlatinumelectrodeMagnet发光Ru2+基态Ru2+激发态Ru3+++电化学发光法原理在电场的作用下，三丙胺（TPA）被氧化成阳离子自由基TPA+，后者很不稳定，可自发失去一个质子（H+），形成自由基TPA，这是一种很强的还原剂，可将一个电子给三价的三联吡啶钌衍生物[Ru(bpy)3]3+，使其形成激发态的[Ru(bpy)3]2+，而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。激发态的[Ru(bpy)3]2+通过荧光机制衰减，发射出一个波长620nm的光子，重新生成基态的[Ru(bpy)3]2+。该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，光强度与[Ru(bpy)3]2+的浓度呈线性关系，故可测出待测抗原的含量。时间分辨荧光•将三价稀土离子铕（Eu）等通过络合物标记到抗原或抗体分子上，通过检测铕等的荧光实现免疫分析应注意环境及样品中同类元素导致的本底干扰，特别是北方地区时间分辨荧光增强原理发光信号检测光敏二极管、光敏电池、光电偶合器（CCD）结构简单、性能稳定但灵敏度低、线性范围较窄。主要特点原理：光信号光电转换器件电压或电流信号放大单光子计数器是目前高灵敏度发光分析仪的核心部件光电倍增管高压高速放大器高速比较器高速分频器发光样品产生光子激发光阴极产生光电子在阳极上形成较强信号脉冲信号相对发光单位数字脉冲(RLU)在各打拿极之间得到能量和数目的倍增流动池检测方式示意图检测器检测池负压泵废液四通阀冲洗液样品管计量泵干燥空气原位进样泵氧化剂优点：结构简单，运行成本低缺点：明显的易产生交叉污染，工作效率受限。常见进口发光免疫分析产品生产厂商产品技术类型反应体系产品特点仪器类型ROCHE电化学发光、磁微珠肿瘤标志物E170ABBOTT化学发光、磁微珠碱性磷酸酶、吖啶酯乙肝项目I2000Bayer化学发光、磁微珠吖啶酯内分泌项目ADVIACentaurBeckman化学发光、磁微珠碱性磷酸酶UniCelDxI800DPC化学发光、塑料球碱性磷酸酶药物分析Immuline2000强生化学发光辣根过氧化物酶丙肝生物梅里埃化学发光碱性磷酸酶HIVPE(Wallac)时间分辨荧光（第二类）胶体金（硒、乳胶）类试剂•胶体金法：梅毒抗体-乙肝表面抗原诊断试剂盒•胶体硒法：HIV(1+2+0)试剂盒胶体金试剂原理硝酸纤维膜加样检测区对照区(HBsAg)-----------------------------玻璃纤维膜-------------------抗HBs羊抗鼠鼠抗HBs胶体金免疫层析法反应示意图吸样垫胶体金垫包被T线包被C线上样垫NC膜支撑物HIV胶体金类快速诊断试剂检测结果第三类）免疫印迹试剂•免疫印迹试剂盒:风湿病自身抗体检测试剂盒（免疫印迹法）免疫印迹法示意图用于RR样品的HCV抗体确认独特的IgG（I/II）及hSOD内部质控设计用于检测的固相化抗原重组表达蛋白：c33c，NS5合成肽抗原：c100p（5-1-1p），c22pIgGcontrolIIIgGcontrolIIDc100(p)5-1-1(p)c33cc22(p)hSODNS5RIBA®HCV3.0c100-3NS5c33cc22-3SOD3+Control1+ControlPosINDPosNegINDRIBA模式图3+controlband(serumaddition)CapsidNS3-1NS3-2NS4NS51+controlband(reagentaddition)GLDHCVBLOT3.0（第四类）蛋白芯片（微阵列）类试剂•蛋白芯片（微阵列）：丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒（蛋白芯片法）；•多肿瘤标志物检测试剂盒（蛋白芯片法）每张芯片检测48个样本，每个样本同时检测5个指标，丙型肝炎病毒分片断抗体检测蛋白芯片NS4NS4NS3NS3CC总总NS5NS5（C代表核心,NS3,NS4,NS5代表非结构区抗原）阳性对照阴性对照空白对照（第五类）单抗类试剂•血型定型类试剂：血型定型试剂盒（单克隆抗体）•免疫组化：ImmuChem免疫组化试剂盒（单抗）•免疫比浊：血清载脂蛋白A1免疫比浊试剂盒•乳胶凝集：D-dimer二聚体乳胶凝集试剂盒（第六类）多抗类试剂•血型定型类试剂：血型定型试剂盒（人血清/马血清）•免疫组化：癌胚抗原检测试剂盒（多抗）•免疫比浊：β-微球蛋白测定试剂盒（免疫比浊法）•乳胶凝集：沙门氏菌乳胶凝集试剂盒抗原•抗原：指进入有免疫活性的组织（宿主）而引发免疫应答的物质。或虽不能引发免疫，但可以同抗体结合的物质。蛋白质，多糖，核酸，糖脂，青霉素•全抗原性具有多个抗原决定族抗体•宿主对体内存在的外来分子，微生物或其他因子的应答而产生的蛋白质（免疫球蛋白，丙种球蛋白）•根据抗体性质：多克隆抗体，单克隆抗体•根据抗体分子结构：IgA,D,E,G,MIgGIgM抗体模式图单克隆抗体•由一株淋巴细胞产生，针对一种抗原决定族•抗原免疫小鼠-取脾脏-与瘤细胞融合-克隆筛选-单克隆抗体细胞株•扩增细胞-注射入小鼠腹腔-采腹水-纯化抗体流程杂交瘤技术多克隆抗体•针对多个抗原决定族•抗原免疫动物-采集动物血清•纯化抗体血型抗原/RBC抗体/外周血AAanti-BBBanti-AOnoneanti-A&anti-BABA&BnoneABO血型测定空气柱微柱玻璃珠反应舱试剂结果判读（第七类）诊断血清（菌液）•诊断血清：侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清；•志贺氏菌属四种混合多价血清•诊断菌液：伤寒沙门菌菌体（O）抗原、鞭毛（H）抗原诊断菌液诊断血清工艺流程采集血清收集抗体（离心机）效价检测等分装、冻干免疫动物免疫抗原制备分离血清灭活处理吸收非特异性抗体吸收用抗原制备诊断菌液工艺流程效价检测等分装、包装细菌培