第10章基因诊断Genediagnosis中国医科

1第十四章基因诊断和基因治疗GenediagnosisandGeneTherapy第一节基因诊断第二节基因治疗2第一节基因诊断重组DNA技术极大地丰富了我们对人类遗传病分子病理学的知识，同时也提供了从DNA水平对遗传病进行基因诊断的手段。基因诊断：就是利用DNA重组技术从DNA水平检测人类遗传性疾病的基因缺陷，又称DNA分析法。3一、直接诊断直接检测致病基因本身的异常。通常使用基因本身或邻近的DNA序列作为探针，或通过PCR扩增产物，以检测基因点突变、缺失、插入等异常及性质。它主要适用于已知基因异常疾病的诊断。41、Gene缺失遗传病的诊断1）α地贫的Gene诊断α基因不同程度的缺失引起不同类型的α地贫，α基因缺失1～4个。正常Gene组用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一个αGene时可得到10kb片段。BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobe5以αGene为探针，Southernblot方法检测αα/αααα/α-αα/--α-/----/--正常缺1缺2缺3缺414kb10kb62）DMD/BMD的缺失诊断（进行性肌营养不良或假肥大型）DMD是一种严重致死性疾病（XR），临床症状表现肌肉进行性萎缩和乏力。BMD临床症状与DMD相似，但症状较轻。Gene定位Xp21，Gene2300kb,79个Exon，cDNA全长13974bp编码3685Aa，分子量427kD。DMD/BMD70%左右为缺失型，基因很大，缺失可能发生在不同的部位。应用多重PCR扩增检测，判断缺失状态。7多重PCR扩增后电泳检测结果病例外显子12345678Pm34350136476052bp53511382、突变型遗传病的基因诊断例如：镰形细胞贫血的Gene诊断已知突变基因编码β珠蛋白链的第6位密码子GAG——GTG谷Aa——缬Aa91）RFLP诊断已知限制酶MstII识别序列MstII1.15kbCCTGAGG1.35kbxprobeCCTGTGG突变后不能识别，酶切位点消失，限制酶切片段长度发生变化。10限制酶切片段电泳后，经SouthernBlot检测，结果：1.35kb1.15kbβΑ/βΑβΑ/βSβS/βS正常镰状镰状贫血112）ASO探针诊断已知突变Gene部位和性质，合成寡和苷酸探针，32P标记，进行SouthernBlot杂交/斑点杂交。NormalβΑGeneProbe——与正常βΑ杂交MutationβSGeneProbe——与异常βS杂交12斑点杂交结果：βΑ/βΑβΑ/βSβS/βS正常探针突变探针13二、间接诊断主要通过Gene和DNA多态的连锁分析作出诊断。当致病基因虽然已知，但其异常尚属未知时，或疾病Gene本身尚属未知时，可通过对受检者及其家系进行连锁分析，推断受检者是否获得了带有致病基因的染色体或DNA片段。连锁分析是基于遗传标记与Gene连锁，子代是否获得遗传标记间接地判断做出诊断。这些遗传标记是基因组中的DAN多态，如：RFLP，VNTR等。141、Gene异常不明确的遗传病的诊断例：成年型多囊肾病——APKD，AD，临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。APKD——Gene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，但已证实APKDGene与α珠蛋白基因3`端附近的一段小卫星DNA序列（3`HVR）紧密连锁，因此，可以通过RFLP连锁分析进行诊断。15以3`HVR为probe与PvuII酶切后的家系有关成员的Gene组DNA杂交——SouthernBlot杂交Gene组DNAprobe（3`HVR）PvuII酶切DNA片段杂交结果16结果12123455．7kb3．4kb2．3kb17结果分析患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段,说明致病基因与3.4kb片段连锁,并按孟德尔方式遗传.II5不含3.4kb片段,产前诊断正常.18PCR—RFLP诊断甲型血友病的基因诊断，已知甲型血友病XR，获得家系成员基因组DNA。PCR142bpBcLI142bp99bp43bp电泳结果分析？p1p2142bp99bp43bpBclIBclI-BclI+19问:1/Ⅱ2、Ⅲ1诊断；2/Ⅲ1是男或是女发病？142bp99bp12123ⅠⅡIII120结果分析1）先症者II2具有99bp片段而发病，该片段来自母亲。2）II2有142bp/99bp杂合子。142bp来自父亲，为正常片段，99bp片段是来自母亲而成为携带者。3）Ⅲ1为99bp片段如果是男性为患者（99bp片段来自母亲）；女性为携带者（来自父母双方）21基因诊断意义现证病人的诊断：争取有效、针对性治疗。产前诊断：意义更为重要，预防遗传病患儿的出生