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国家自然科学基金申请书（2016版）资助类别：青年科学基金项目亚类说明：附注说明：项目名称：Poly(A)化GANT61纳米颗粒靶向治疗胶质瘤的实验研究申请人：电话：依托单位：通讯地址：邮政编码：单位电话：电子邮箱：申报日期：国家自然科学基金委员会申请代码受理部门收件日期受理编号国家自然科学基金申请书第1页申请人信息姓名性别出生年月民族学位职称每年工作时间（月）电话电子邮箱传真国别或地区个人通讯地址工作单位主要研究领域依托单位信息名称联系人电子邮箱电话网站地址合作研究单位信息单位名称项目基本信息项目名称Poly(A)化GANT61纳米颗粒靶向治疗胶质瘤的实验研究英文名称studyOfPolyfunctionalizedGANT61Nanoparticlestargetingtreatmentofglioma资助类别亚类说明附注说明申请代码基地类别研究期限申请经费23.8000万元中文关键词GANT61；SHH信号通路；纳米颗粒；胶质瘤；靶向治疗英文关键词GANT61;SonicHedgehogSignalingPathway;Nanoparticles;glioma;targetedtherapy基本信息国家自然科学基金申请书第2页中文摘要胶质瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤之一，许多患者治疗后常常遗留神经系统功能缺陷和认知障碍，严重影响着患儿的生存质量。因此，寻找新型、高效、安全的治疗方法对于治疗胶质瘤具有重要意义。我们在前期的研究中发现，Gli1蛋白的表达与胶质瘤的发生相关。Gli1靶向抑制剂GANT61能够明显抑制胶质瘤的增殖生长，促进其凋亡。但同时GANT61还存在着一定的缺限。为此，本项目拟结合体内和体外实验，通过利用GANT61与Poly腺嘌呤(A碱基)氢键特异性结合，同具有良好生物相容性的二氧化硅纳米颗粒相结合，研究一种Poly(A)化GANT61二氧化硅纳米颗粒。通过免疫组化、westerblot、qPCR、流式细胞术、cck8等实验，深入研究其在胶质瘤增殖及凋亡的作用，为提高胶质瘤的治疗效果提供新的思路和理论依据。英文摘要Glioma(MB)isthemostcommonmalignantbraintumor,andclinicaloutcomeisworse.Manypatientssufferfromconsiderablelong-termdisabilityandmorbidityafteraggressivemultimodaltherapy.Therefore,itisimportanttofindanovel,efficient,safetytherapeuticmethodforglioma.ourresultsindicateasignificantroleforGli1intheproliferationofMB,andmoleculartargetingofGli1,GANT61,isapotentialtherapeuticapproachtoinhibitorytumorproliferationandinducedcellapoptosisofMB.However,GANT61hassomedisadvantages.Therefore,thisprojectintendstocombineinvivoandinvitroexperiments.CombinedGANT61,Poly(A)withsilicananoparticlescansynthesiseGANT61withPoly(A)silicananoparticles.Itassaysbyimmunohistochemistry,westernblot,qPCR,flowcytometryandCCK8toinvestigatetumorproliferationandcellapoptosisofMB.Inordertoimprovethetreatmenteffectofgliomaprovidesnewtrainofthoughtandtheorybasis.国家自然科学基金申请书项目组主要参与者（注:项目组主要参与者不包括项目申请人）编号姓名出生年月性别职称学位单位名称电话电子邮箱证件号码每年工作时间（月）总人数高级中级初级博士后博士生硕士生第3页国家自然科学基金申请书第4页国家自然科学基金项目资金预算表金额单位：万元序号科目名称金额1一、项目资金23.80002(一)直接费用20.000031、设备费2.00004(1)设备购置费1.005(2)设备试制费1.006(3)设备改造与租赁费0.000072、材料费8.0083、测试化验加工费0.5094、燃料动力费1.00105、差旅费1.00116、会议费1.00127、国际合作与交流费0.50138、出版/文献/信息传播/知识产权事务费2.00149、劳务费3.001510、专家咨询费1.001611、其他支出0.000017(二)间接费用3.800018其中：绩效支出0.950019二、自筹资金0.0000国家自然科学基金申请书第5页预算说明书（定额补助）、（请按《国家自然科学基金项目资金预算表编制说明》中的要求，对各项支出的主要用途和测算理由及合作研究外拨资金单价≥10万元的设备费等内容进行详细说明，可根据需要另加附页。）科目申请经费（万元）备注（计算依据与说明）一、项目资金：23.8(一)直接费用：201、设备费：2(1)设备购置费：1(2)设备试制费：1(3)设备改造与租赁费：2、材料费：8细胞系、细胞培养液、细胞凋亡检测试剂盒、各种一抗等，具体见经费申请说明3、测试化验加工费：0.5纳米颗粒合成、RNA引物合成、流式细胞仪检测等4、燃料动力费：1水、电和实验室平台的有偿使用费5、差旅费：1参加学术会议交流和实验经验交谈会议6、会议费：1参加国内和国际学术会议交流7、国际合作与交流费：0.5到国内外先进实验室学习和交流的来回机票、住宿等8、出版/文献/信息传播/知2文献检索、复印打印、版面费、信识产权事务费：息咨询、通讯费等9、劳务费：3直接参加项目研究的研究生的劳务费用10、专家咨询费：111、其他支出：(二)间接费用：其中：绩效支出：二、自筹资金：5.协作费国家自然科学基金申请书第6页（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）：1.项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）；1.1研究意义胶质瘤(glioma)是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤之一，约占儿童脑肿瘤的25%。具有生长迅速、手术难以彻底切除的特点。近年来开展的以手术切除并结合放化疗的综合治疗仅能治愈部分病例，还有相当多的胶质瘤患者治疗后遗留神经系统功能缺陷和认知障碍，严重影响着患者的生存质量。因此，对胶质瘤的靶向治疗和分子机制的深入研究，将为治疗胶质瘤的治疗提供更多的理论依据和实验基础。寻找治疗GB更安全有效的方法，并尽可能减少后遗症是十分必要的，具有重大的社会意义。SHH信号通路（SonicHedgehogPathway,SHH）的传递过程可以简单总结四个部分：SonicHedgehog（SHH配体蛋白）-Ptch（跨膜蛋白受体）-Smo（跨膜蛋白）-Gli（转录因子）的传递过程。Gli是该信号通路下游终末端的转录因子，调控着下游CyclinD1、N-myc、PTCH1、bcl-2和bax等多个靶基因。GANT61是该通路下游的Gli抑制剂，它主要与Gli1DNA结合，抑制Gli1、Gli2锌指蛋白活性，从而拮抗SHH信号通路Smo下游Gli1等转录因子的转录活性。虽然多项研究表明GANT61能够明显抑制肿瘤的生长增殖，促进肿瘤细胞的凋亡，但GANT61同样也存在着一定的缺点，如何提高药物的靶向运输，提升治疗效果，降低药物的不良反应等一系列问题，都需要通过一种新型的载体材料来解决。1.2国内外研究现状及发展动态分析随着新世纪生物材料科学的发展，功能化的纳米材料在肿瘤的治疗方面存在着广阔的应用前景。通过构建纳米药物载体，能够实现药物精准的控制释放，提高药物的靶向运输效率和治疗效果，并且能够大大减少药物的不良反应。同时，聚腺嘌呤(PolyA)广泛存在于生物体中，和生命的活动息息相关，尤国家自然科学基金申请书第7页其是在RNA的转录和翻译之中发挥着重要作用。而且，许多肿瘤细胞的mRNA末端往往存在着过度表达(PolyA)尾端。很多研究发现，利用mRNA末端的Poly(A)作为药物靶点，其能够通过与药物的氢键特异结合，可以抑制mRNA的翻译，从而抑制肿瘤的发生发展。同时，由于氢键结合力介于共价结合和静电吸附之间，在一定的条件下(如低pH、升温)，其结合力将会下降。因此，利用Poly(A)能够和药物之间相互作用的特点进行装载药物，可能会成为一种新型的抗肿瘤药物载体。因此，利用小分子GANT61化合物与腺嘌呤(A碱基)氢键特异性结合，并在酸性环境下结合力将会下降的特点，同具有良好生物相容性、DNA酶切保护性以及易于生物修饰的二氧化硅纳米颗粒相结合，研究一种基于(PolyA)和二氧化硅纳米颗粒(Silicacoatednanoparticles,SiNPs)的，并且能够通过肿瘤的酸性环境进行可控性的释放抗肿瘤药物，将是一种更新型、更有效、更安全和更有前景的治疗方式，对胶质瘤的治疗过程具有重要意义。国家自然科学基金申请书第8页2.项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键科学问题（此部分为重点阐述内容）；2.1研究内容(1)在体外分离培养DOAY细胞，研究GANT61对胶质瘤DOAY细胞增殖抑制的影响，通过流式细胞术检测GANT61对胶质瘤的促凋亡作用，Westernblot和qPCR等实验研究胶质瘤中DOAY细胞SHH信号通路中Gli1、Gli2、CyclinD1、Caspase3、Caspase9、Bax、Bcl-2等表达情况。(2)成功构建Poly(A)化GANT61纳米颗粒。分别通过高分辨电镜、高效液相色谱法检测、CCK8法和激光共聚焦研究等实验研究合成纳米颗粒的表面特征、纳米颗粒药物的包封率和载药量、细胞的抑制率和细胞的吞噬及释放。(3)制作胶质瘤裸小鼠移植瘤模型，使用构建成功的Poly(A)化GANT61纳米颗粒颈内动脉注射移植裸小鼠胶质瘤进行动物实验，Westernblot、免疫组化及qPCR等实验研究胶质瘤中SHH信号通路中Gli1、Gli2、CyclinD1、Caspase3、Caspase9、Bax、Bcl-2等表达情况。2.2研究目标(1)在体外培养胶质瘤Doay细胞，研究SHH信号通路靶向抑制剂GANT61对胶质瘤Doay细胞增殖抑制的影响。(2)合成Poly(A)化GANT61纳米颗粒，分别通过高分辨电镜、高效液相色谱法检测、CCK8法和激光共聚焦研究等实验研究合成纳米颗粒的表面特征、纳米颗粒药物的包封率和载药量、细胞的抑制率和细胞的吞噬及释放。(3)Poly(A)化GANT61纳米颗粒靶向治疗裸鼠胶质瘤，再使用免疫组化、westenblot和qPCR检测胶质瘤中SHH信号通路中相关蛋白和基因的表达情况。2.3拟解决的关键科学问题1、在体外构建建立Poly(A)化GANT61纳米颗粒合成，目前我们已经进行了相关的研究。2、使用透射电子显微镜、电泳、高效液相色谱仪等方法检测纳米颗粒的形貌、电位、稳定性、载药量、包封率以及考察GANT61在不同pH值溶液的释放行为。国家自然科学基金申请书第9页再通过激光共聚焦扫描仪考察细胞对颗粒的吞噬以及吞噬后颗粒的定位。3、建立裸鼠的胶质瘤模型具有一定的技术困难，本课题组已经在前期准备工作中进行了初步的研究。国家自然科学基金申请书第10页3.拟采取的研究方案及可行性分析（包括研究方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）；3.1研究方案（1）细胞培养细胞培养在体外分离培养DOAY细