(完整版)北京大学医学部攻读硕-博士学位研究生课题研究计划书

北京大学医学部攻读博硕士学位研究生课题研究计划书研究生李玉霞学号1411210743年级2014级院（部）北京大学/香港科技大学医学中心专业医学生物化学与分子生物学导师方征宇课题研究开始日期:2015年03月09日北京大学研究生院医学部分院培养办公室制表1说明一、本计划书由研究生本人在本学科内作过开题报告后填写，一式三份；经院(部)主管部门批准后一份留教研室，一份留院（部）主管部门，一份送研究生院医学部分院培养办公室备案。二、计划批准后不得随意更改。如有特殊情况确需变更者，需填写变更报告，逐级审批。2研究课题名称黑色素瘤顺铂获得性耐药相关microRNA筛选及其功能的研究研究课题的目的、理论与实际意义、国内外研究情况简介课题的目的：1、构建黑色素瘤顺铂获得性耐药细胞株，与其原始株进行microRNA的高通量筛选比较，找到耐药相关的microRNA，作为潜在的治疗靶点。2、分析耐药相关microRNA通过调控哪些基因的表达来影响黑色素瘤细胞的耐药性，阐明其分子机制。理论与实际意义：近几十年来,恶性黑色素瘤在全球的发病率迅猛升高,成为所有恶性肿瘤中发病率增长最快的肿瘤,年增长率几乎达到3-5%。其中白色人种发病率明显高于其他人种,,我国和日本等亚洲国家的黑色素瘤发病率与欧美国家相比相对较低,但近年来其发病率呈迅猛上升趋势。恶性黑色素瘤治疗方法主要有手术治疗、放射治疗、化学药物治疗及生物免疫治疗等。化疗在恶性黑色素瘤治疗中仍占有重要地位。目前化疗药物主要有顺铂、长春新碱和组蛋白去乙酰化酶抑制剂等。顺铂是现在临床上多种化疗方案中的主要药物之一,通过与癌细胞的脱氧核糖核酸发生交叉联结,诱导肿瘤细胞的凋亡而起抗癌作用,属细胞增殖周期非特异性药物，但是多种恶性黑色素瘤常会对顺铂产生天然或获得性耐药,因而提高顺铂的抗肿瘤作用,解决顺铂耐药在恶性黑色素瘤的化疗中有着重要的实际意义。顺铂耐药机制,主要包括细胞内药物积累的减少，DNA损伤修复作用增强,凋亡通路的变化以及一些microRNA的异常表达。由于microRNA的表达易于调控，如果能找到黑色素瘤中与耐药相关的microRNA，可建立以此为靶点的干预手段。国内外研究情况简介：在其他肿瘤细胞中，已经有人验证出一些microRNA的变化会影响肿瘤对顺铂的敏感性，而目前关于microRNA在黑色素瘤顺铂获得性耐药机制中的作用研究较少。3主要研究内容研究内容1：构建黑色素瘤顺铂耐药株选取了七种黑色素瘤细胞系M7、M21、SK-MEL-103、M29、A375、M8、SK-MEL-19依次检测对顺铂的敏感性,在对顺铂比较耐受的细胞株中选取了A375、M8、SK-MEL-19构建了顺铂耐药株并将A375、M8做了microRNA的表达谱芯片。研究内容2：黑色素瘤顺铂耐药株与原始株microRNA芯片分析及验证通过分析microRNA表达谱芯片，对黑色素瘤顺铂耐药株中异常表达的microRNA用荧光定量PCR进行验证，确定要研究的microRNA。研究内容3:顺铂耐药相关基因反向筛选预测microRNA查阅文献，汇总顺铂耐药相关基因，在黑色素瘤顺铂耐药株与原始株中用荧光定量PCR验证，根据耐药基因的变化反向预测microRNA。研究内容4：microRNA对黑色素瘤顺铂耐药的影响及其分子机制根据microRNA靶基因预测数据库找到靶基因，进一步研究microRNA对顺铂黑色素瘤耐药的影响及其分子机制。4主要研究方法1、构建黑色素瘤顺铂耐药株MTS法检测药物敏感性以及顺铂耐药株的耐药指数。2、黑色素瘤顺铂耐药株与原始株microRNA芯片分析及验证Real-timePCR验证microRNA芯片结果。3、顺铂耐药相关基因反向筛选预测microRNAReal-timePCR验证顺铂耐药相关基因，microRNA靶基因预测数据库分析结果。4、microRNA对黑色素瘤顺铂耐药的影响及其分子机制Dual-LuciferaseReporter验证microRNA与靶基因的关系，慢病毒构建靶基因相关稳转株，WesternBlotting验证靶基因相关蛋白的变化。研究进度及具体安排2015年3月-2015年8月进度：黑色素瘤顺铂耐药株构建2015年9月-2015年12月进度：microRNA芯片分析及验证,顺铂耐药相关基因的筛选2016年1月-2016年10月安排：microRNA对黑色素瘤顺铂耐药的影响及其分子机制的研究预期结果1、通过microRNA芯片找到与黑色素瘤顺铂耐药相关的microRNA2、通过microRNA靶基因预测数据库找到microRNA的靶基因3、microRNA的靶基因通过调节细胞内的相关蛋白对顺铂耐药有作用，通过敲除或者过表达该基因可以逆转黑色素瘤顺铂获得性耐药。5完成课题的条件协助导师具体指导的人员配备周游博士后、细胞培养技术员黎满慧、试剂采购技术员董小林主要仪器设备情况Bio-RadPCR仪、Bio-RadRael-timePCR仪、Bio-Rad酶标仪、Bio-Rad蛋白电泳仪、Eppendorf离心机、Stuart涡旋振荡器、WiseTherm干浴锅、超净台、显微镜、-20℃冰箱等实验动物情况没有动物实验药物试剂等来源情况DMEM(GIBCO)、PBS(Invitrogen)、Tyrisin(GIBCO)、MTS(Promega)、Lipofection2000(Promega)、RTkit(Promega)、Real-timesupermix(Promega)、BCA(TransGenBiotech)、BSA(sigma)等。协作单位及协作内容落实情况没有其它6导师审查意见：导师签名：年月日教研室（研究室）审查意见：主任签名：年月日院(部)主管部门审批意见：院（部）盖章：年月日