细菌诊断学

细菌学诊断基础韩惠瑛第一部分绪论•微生物包括•非结构型：体积小，不具备细胞结构，必须在活细胞内才能增殖，如病毒。•原核细胞型：仅有核质，无核膜和核仁，缺乏完整细胞器，如细菌、螺旋体、支原体•真核细胞型：细胞核的分化程度高，有核膜、核仁和染色体，完整的细胞器，如真菌•微生物的分布广•利与弊-----能引起人和动物发病的细菌称为病原菌•微生物的发展史——19世纪中叶发展为一门科学，实际是从发明显微镜之后发现了微生物世界•1、形态学时期，17世纪末至19世纪中叶近200年•2、生理学及免疫学时期•3、近代微生物时期一、细菌基本形态球菌：单球、双球、链球、葡萄球菌…杆菌：短杆、长杆、棒杆、梭杆等。螺菌：弧菌、螺旋菌等。第二部分细菌基本形态与结构1、球菌链球菌：注意其链状排列，链的长短，个体的形态。葡萄球菌：注意其无一定次序，无一定数目，不规则地堆放在一起的形态。双球菌：两辆相连，呈肾壮、扁豆状或毛尖状双球菌（diplococcus）脑膜炎萘瑟菌肺炎双球菌+葡萄球菌Staphylococcus葡萄球菌电镜片葡萄球菌革兰氏染色+葡萄球菌（Staphylococcus）链球菌Streptococcus(Hemoculture)猪链球菌的形态+四联球菌（Tetracoccus）八叠球菌（Sarcina）2、杆菌（bacillus，bacilli）•菌体呈圆柱形或近似卵圆形,杆菌的种类很多，其长短、粗细及显微镜下的形象很不一致。大肠杆菌E.coli大肠杆菌E.coli沙门氏菌Salmonella.sp大肠杆菌(SEM)沙门氏菌salmonella(SEM)布氏杆菌BacteriumburgeriG-铜铝假单胞杆菌（绿脓杆菌）G-产气荚膜梭菌Clostridiumperfringens产气荚膜梭菌(SEM)乳酸杆菌lactobacilli结核杆菌Tbc(SEM)枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis(SEM)单核细胞增生性李氏杆菌(SEM)炭疽繁殖体(SEM)空肠弯曲杆菌(SEM)双歧杆菌鼻疽杆菌细直、微弯两端钝园的G-杆菌炭疽杆菌炭疽杆菌炭疽杆菌在动物体内的形态炭疽杆菌蜡状杆菌炭疽杆菌禽分支杆菌结核分支杆菌李氏杆菌鼠伤寒沙门氏菌(x20,800)肉毒杆菌（C.botulinum）白喉棒状杆菌大肠杆菌E.coli(0157:H7志贺氏痢疾杆菌(x22,400)3、螺旋状菌（spirillum）•菌体呈弯曲或螺旋状的园柱形，两端圆或尖突•又可分弧菌和螺菌两种•弧菌vibrio：菌体只有一个弯曲，呈弧形或逗点状，•螺菌spirillum：菌体较长，有两个以上的弯曲，捻转呈螺旋状螺旋状菌（spirillum）螺菌弧菌霍乱弧菌(x15,575)梅毒螺旋体Microspironemapallidum钩端螺旋体二、细菌的结构内部结构细胞浆核蛋白体核体（核质）质粒间体内含物芽孢细胞膜菌毛表层结构外部附件鞭毛细胞壁荚膜按分布部位大致可分为习惯上：细菌的结构基本结构特殊构造细胞壁、细胞膜、细胞浆、核物质、核糖体和内含物等细菌基本生命活动中所必需各种细菌都具有的结构如荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢等与基本生命活动没有多大关系并不是所有细菌都有这些结构细胞质间体菌毛荚膜细胞膜鞭毛内含颗粒核糖体核体细胞壁/外膜（如果存在）•细胞壁(Cellwall)•细胞壁位于细菌细胞最外层，贴近胞浆膜之外，是一层无色透明，坚韧而具有一定弹性的膜状结构。•细菌细胞壁化学组成结构不同，将细菌分为-革兰氏阳性菌G+-革兰氏阴性菌G-革兰氏阳性菌细胞壁模式图革兰氏阴性菌的细胞壁模式图革兰氏阳性菌和阴性菌细胞壁电镜图革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌GramstainofGram+StaphylococcuscellsGramstainofGram-E.colicells细菌芽孢破伤风芽孢杆菌Bacillustetani细菌荚膜粘液层鞭毛荚膜普通染色光镜观察肺炎球菌荚膜三、细菌的营养•细菌的化学组成：水（70-90%）、固形物（10-30%）•细菌的营养物质：水、糖类、蛋白质、无机盐、生长因子四、细菌的生长繁殖•条件：营养、温度、酸碱度、渗透压、气体环境•繁殖方式与速度：简单的二分列式。迟缓期、对数期、稳定期、衰老期。五、细菌的新陈代谢•酶在新陈代谢中作用：胞内酶、胞外酶•呼吸类型，对氧的需求：专性需氧菌、专性厌氧菌、兼性厌氧菌•代谢产物：糖---糖发酵试验、甲基红试验、伏-普试验。蛋白质---吲哚试验、硫化氢试验、尿素试验、硝酸盐还原试验。其他代谢产物：无机酸、有机酸、氨基酸、醇类、脂类、维生素、抗生素、毒素。第三部分细菌病的诊断程序一、诊断的依据畜禽细菌性病少数可根据流行情况、临床症状做出诊断，如破伤风。•畜禽细菌性病多数在流行情况调查、临床症状、病理剖解的基础，结合实验室诊断做出最后确诊。•诊断方法有：显微镜检查（光镜、电镜）、病原的分离培养、血清学抗体检测、病原的分子生物学检测。•二、细菌实验室诊断内容无菌操作贯穿始终病料的采集和运送病料处理细菌的分离与接种细菌的培养鉴定病料采集涂片、染色镜检染色及形态特征分离培养观察培养特性挑取可疑菌落纯培养食物中毒的呕吐物或疑似剩余食物涂片、染色、镜检生化试验毒素检测细菌分离鉴定程序血清学试验动物试验血清学试验分子生物学动物实验病料的采集1、病料采集基本原则*采样所用器械应事先消毒。无菌操作贯穿始终。*对急性死亡的动物，从耳尖或四肢末梢血管取血制成涂片，染色镜检，在排除炭疽后方能剖检取样。*要分离病原菌，应采集到含菌最多的组织脏器。采集的病料要尽可能齐全，除了内脏、淋巴结和局部病变组织外，还应采取脑组织和骨髓，以防遗漏。*病料应新鲜，动物死后，应立即采集，夏天不宜超过6-8小时，冬天不应迟于24小时。*采集、包装和送检过程中要注意安全，做好个人防护和环境消毒，防止病原菌的扩散。*做好记录和标记采集的病料内脏器官血液粪便浓汁皮肤和粘膜脑和脊髓胆汁肠和胃乳汁流产胎儿2、病料采集方法•液体材料的采集•内脏•皮肤及羽毛•胎儿•检出形态与染色上具有特征性的病原菌，有助于病原的初步诊断或确诊，如痰液检出抗酸性分支杆菌形态学检查特定部位的标本直接涂片染色后镜检分离培养在细菌学诊断中，分离培养是不可缺少的一环。主要是在含许多细菌的病料或培养物中挑选出某种细菌。选择适合于所分离细菌生长的培养基、培养温度、气体条件等。同时应严格按无菌操作程序进行实验，并做好标记。分离培养的目的分离培养时应注意2、细菌的分离培养无菌采集的标本污染的标本选择或鉴别培养基选择适宜的培养基是分离出病原菌的重要环节固体或液体培养基大多数细菌37℃经16~24h可形成可见菌落少数生长缓慢的细菌需1~3周才能形成可见菌落。如布氏杆菌、结核杆菌等绵羊布氏杆菌和流产布氏杆菌初次分离时，须在5%~10%的CO2环境中才能生长根据细菌对气体的要求适当的气体环境•油镜的使用•细菌抹片的制备•几种常用的染色方法•培养基的制作•细菌生长形状的观察•细菌的生化性状观察•药物敏感试验五、细菌抹片的制备•玻片准备•抹片•干燥•固定•染色•镜检六、几种常用的染色方法•1、革兰氏染色法原理利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。•革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的重要鉴别染色法，通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰阳性细菌（G+）和革兰氏阴性细菌（G—）两大类。链球菌革兰氏染色链球菌革兰氏染色脓疱中金黄葡萄球菌革兰氏染色GramstainofStaphylococcusaureusinpustularexudate组织细胞白细胞内的葡萄球菌葡萄球菌创口感染革兰氏染色涂片•2、抗酸染色法•抗酸杆菌类一般不易着色，需用强浓染液加温或长时间才能着色，但一旦着色后即使使用强酸、强碱或酒精也不能使其脱色。其原因一是细菌细胞壁含有丰富的蜡质（分支菌酸），它可阻止染料透入菌体内着染，但一旦染料进入菌体后就不易脱去；二是菌体表面结构完整，当染料着染后即能抗御酸类脱色，若胞膜及胞壁破损，则失去抗酸性染色特性。萋-尼（Ziehl-Neelsen）氏染色法•结核杆菌（抗酸染色）•3、瑞特氏染色法九、细菌生长形状的观察霍乱弧菌在TCBS的平板上的菌落特征伤寒沙门菌在CHROMagar显色培养基上的菌落特征梭菌在CCFA培养基上的生长特性布鲁氏菌的菌落炭疽芽孢杆菌的菌落鼠疫耶氏菌菌落禽霍乱菌菌落枯草芽胞杆菌菌落链球菌的β溶血环在血液琼脂平板形成的菌落较大，多数致病菌株能形成β溶血。溶血现象α-溶血——草绿色溶血β-溶血——菌落周围形成明显的全透明溶血环γ-溶血——不溶血十、细菌生化实验观察•生化实验前进行纯度检查•检查方法•镜检时要适当多看几个视野，每个视野中细菌形态与染色特性均须符合该菌种的特性。（1）糖发酵管接种：（2）蛋白胨水接种：吲哚试验。（3）葡萄糖蛋白胨水接种：接种两管，分别作MR试验和VP试验。（4）尿素琼脂接种（5）枸橼酸盐琼脂接种1、生化试验检验项目包括（6）醋酸铅琼脂接种：应靠近管壁穿刺（7）半固体琼脂接种：穿刺线应在培养基中央，一直刺到管底，拔出穿刺针时应顺原穿刺线取出，切不可左右滑动，以免影响观察结果。•以上培养基接种后，在各管管壁上标记菌种号码，然后置于37℃温箱培养2～3d。•糖培养基应每日观察一次•尿素培养基接种的细菌量多时，一般在培养后数小时内出现结果（1）糖发酵试验：–凡培养基变为黄色者，表示该菌发酵此糖产酸（以＋表示）；–凡培养基变黄并含气泡者，表示该菌发酵此糖产酸产气（以⊕表示）；–凡培养基不变色者，表示该菌不发酵此糖（以－表示）。生化特性的观察不产酸不产气产酸不产气产酸产气（2）吲哚试验：•取蛋白胨水培养管先加乙醚少量，塞紧棉塞摇振试管，使乙醚与培养液充分混匀，静置片刻，待乙醚浮于液面上层时，沿管壁加入吲哚试剂2～3滴。–凡在乙醚层内出现玫瑰红色者为阳性反应，–不变色者为阴性反应。色氨酸吲哚玫瑰吲哚吲哚试剂（3）MR试验：•取经2～3d培养的葡萄糖蛋白胨水培养管，加入MR试剂数滴（5滴左右）。–凡液体呈红色者为阳性反应（＋），–呈黄色者为阴性反应（－）–橙黄色者为可疑反应（±）。甲基红-甲基红+对照（4）V-P试验：•取另一支葡萄糖蛋白胨水培养管，先加V-P试剂甲液（6％甲萘酚酒精溶液）3mL，再加V－P试剂乙液（40％KOH溶液）1mL，充分摇匀后静置于试管架上–在数分钟内出现红色者为阳性反应，–不出现红色者应放在37℃继续观察1～2h，仍然不变色者判为阴性。葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇氧化二乙酰胍基化合物（＋）红色化合物葡萄糖→丙酮酸※乙酰甲基甲醇（－）（5）枸橼酸盐利用试验：•观察经2～3d培养的枸橼酸盐琼脂管是否有细菌生长，并观察其颜色变化。–凡有细菌生长，培养基变为天蓝色者，为该菌利用枸橼酸盐–否则为阴性反应。利用枸橼酸盐生长+不能利用-（6）硫化氢试验：•观察经2～3d培养的醋酸铅琼脂管，凡沿穿刺线或其周围出现黑色沉淀者，为H2S阳性反应，无黑色者为阴性反应。空白对照硫化氢试验（7）运动力：•观察半固体琼脂培养管–凡细菌有鞭毛能运动者，则部分或全部半固体琼脂变混浊–凡不运动者细菌仅在穿刺线上生长，穿刺线外围培养基仍然透明。无动力有动力半固体培养基（穿刺培养）空白对照（8）尿素酶试验第四部分常见病原菌的微生物学检查革兰氏阳性细菌动物病原菌的鉴定模式动物病原菌的鉴定模式阳