茚三酮法测氨基酸

茚三酮显色法测定氨基酸的含量一．原理：凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。二．仪器：721型分光光度计台天平减压蒸馏器干燥容量瓶移液枪烧杯试管架试管水浴锅。三．药品：（1）标准氨基酸溶液：配制成0.3mmol/L溶液（2）pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液：量取86mL2mol/L醋酸钠溶液，加入14mL2mol/L乙酸混合而成。用pH检查校正。（3）茚三酮显色液：称取170mg茚三酮和30mg还原茚三酮，用20mL乙二醇甲醚溶解（4）60％乙醇。（5）样品液：每毫升含0.5～50μg氨基酸。茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g茚三酮溶于15～25mL热蒸馏水中，加入0.25g活性炭，轻轻搅拌。加热30min后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g茚三酮，用12.5mL沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。将0.5g维生素C用25mL温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL乙二醇甲醚中加入5g硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。四、操作步骤1．标准曲线的制作分别取0.3mmol/L的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于试管中，用水补足至1mL。各加入1mLpH5.4，2mol/L醋酸缓冲液；再加入1mL茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却。放置5min后，加入3mL60％乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570nm。（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440nm）。以OD570nm为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。1234560.3mmol/L标准氨基酸溶液00.20.40.60.81.0蒸馏水1.00.80.60.40.202mol/L醋酸缓冲液111111茚三酮显色液111111OD570混匀，盖住试管口后在100°水浴加热15min，然后用自来水冷却。放置5min后，加入3ml60%的乙醇稀释，充分摇匀。2．氨基酸样品的测定取样品液1mL，加入pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液1mL和茚三酮显色液1mL，混匀后于100℃沸水浴中加热15min，自来水冷却。放置5min后，加3mL60％乙醇稀释，摇匀后测定OD570nm（生成的颜色在60min内稳定）。将样品测定的OD570nm与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量。