电泳技术

生物分析技术第4讲电泳技术2011年9月第一节电泳技术概述第二节琼脂糖凝胶电泳第三节聚丙烯酰胺凝胶电泳第四节高效毛细管电泳主要内容第一节电泳技术概述1.概念2.电泳技术的发展3.电泳的基本原理4.电泳过程的影响因素第一节电泳技术概述1.概念电泳（electrophoresis）是指带电荷的溶质或粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。利用电泳现象将多组分物质分离、分析的技术叫做电泳技术（electrophoresistechnique）。可以实现电泳分离技术的仪器称之为电泳仪（electrophoresister）。许多重要的生物分子（如氨基酸、多肽、蛋白质、核酸等）都具有可电离基团，在特定的pH溶液中它们可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电离子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、性状等性质差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而进行分离、鉴定等。2.电泳技术的发展历史1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。1937年瑞典大学的蒂塞利乌斯对电泳仪器作了改进，创造了电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及α,β,γ球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面做出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质(如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等)作为支持介质的区带电泳方法。1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。1960年以后，Orenstein和Davis从理论上阐述了聚丙烯酰胺凝胶电泳，并通过改进实验方法使得凝胶电泳技术得以推广应用。20世纪70年代后，根据不同需要又发展了等电聚焦电泳、双向电泳、印迹转移电泳等技术；电泳的模式也从圆盘电泳、垂直板电泳、脉冲电泳等发展到后来的分辨率极高的毛细管电泳；电泳的检测手段也从染色、扫描等方法延伸到紫外吸收、放射自显影、生物活性测定、化学发光、荧光激发以及质谱和核磁共振等方法。近代电泳技术是生物化学和分子生物学中对生物大分子使用最普遍、分辨率最高的分析鉴定技术之一。基本原理物质分子在正常情况下一般不带电，即所带正负电荷量相等，故不显示带电性。但是在一定的物理作用或化学反应条件下，某些物质分子会成为带电的离子（或粒子），不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，因此可使它们分离。电泳现象3.电泳的基本原理若将带净电荷Q的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为：F引=EQ在溶液中，运动粒子与溶液之间存在阻力F阻F阻=6πrηV当F引=F阻时EQ=6πrηVV=EQ/6πrη由上式可以看出，粒子的移动速度(泳动速度V)与电场强度(E)和粒子所带电荷量(Q)成正比，而与粒子的半径(r)及溶液的粘度(η)成反比。大分子性质电场强度溶液的pH和离子强度电渗作用支持介质的筛孔4.电泳过程的影响因素（1）待分离大分子的性质：所带的电荷、分子大小和形状，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快（2）电场强度：过高，产热，样品和Buffer扩散增加，条带增宽；蛋白变性。过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置（3）缓冲液pH和离子强度：pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大；但是pH过高或过低引起蛋白变性，缓冲液通常要保持一定的离子强度；强度过低，则缓冲能力差，不易维持PH恒定，离子强度过高，在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），降低了蛋白质的带电量，使电泳速度减慢。一般所用离子强度为0.02-0.2之间。（4）电渗：在电场中液体对固体支持物的相对移动；当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。（5）支持介质的筛孔：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大5.电泳技术的分类电泳技术的分类（1）根据工作原理的不同：可分为移界电泳、区带电泳、等速电泳、等电聚焦电泳、免疫电泳等。（2）根据有无固体支持物可分为：自由电泳和支持物电泳。（3）根据支持载体的位置或形状可分成：水平电泳、垂直电泳、板状电泳、柱状电泳、U型管电泳、倒V字形电泳、毛细管电泳等。（4）根据支持物的特点又可分为：无阻滞支持物电泳；高密度的凝胶电泳。（5）根据电源控制的不同，一般可分为以下3类：恒压电泳;恒流电泳;恒功率电泳。（6）根据自动化程度的不同，可分为半自动和全自动型。（7）根据其功能的不同，可分为制备型、分析型、转移型、浓缩型等。（8）根据用法的类型可分为：双向电泳、交叉电泳、连续纸电泳、电泳－层析相结合技术等。（9）根据不同的使用目的可分为：核酸电泳、血清蛋白电泳、制备电泳、DNA测序电泳等。（10）根据支持介质的不同可分为：纸电泳（Paperelectrophorisis）醋酸纤维薄膜电泳（CelluloseAcetateelectrophoresis）琼脂凝胶电泳（AgarGelelectrophoresis）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PolyacrylamideGelelectrophoresis）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）第二节琼脂糖凝胶电泳1.琼脂糖凝胶2.琼脂糖凝胶电泳第二节琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如迁移速度大小顺序为:共价闭合环状的超螺旋分子＞线形DNA分子＞开环分子。1.琼脂糖凝胶天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉，从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。琼脂糖（agarose）：琼脂中不带电荷的中性成分琼脂胶（agaropectin）非凝胶部分，是带有硫酸酯（盐）、葡萄糖醛酸和丙酮酸醛的复杂多糖琼脂糖D-半乳糖和3，6-脱水L半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。D-半乳糖3，6-脱水-L-半乳糖琼脂糖凝胶的特点优点因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒等大分子物质。透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定。有热可逆性。缺点机械强度差，易破碎，浓度不能太低。易被细菌污染，不易保存，临用前配制。琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。应用适用于大分子的核酸、核蛋白等的分离、鉴定及纯化临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的分离与检测为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病等提供生化指标DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。实验原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。2.琼脂糖凝胶电泳（核酸分离）琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。凝胶电泳槽实验仪器凝胶成像系统（1）凝胶电泳类型用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳也可分为垂直型及水平型（平板型）。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1~2mm，故又称为潜水式，是目前使用较多的电泳形式，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，因而得以广泛应用。（2）缓冲溶液的配制DNA的电泳迁移率受到电泳缓冲液的成分和离子强度的影响，当缺少离子时，电流传导很少，DNA迁移非常慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流传导非常有效，导致大量热量产生，严重时，会造成胶熔化和DNA的变性。常用的电泳缓冲液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TAE），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，浓度约50mmol/L（pH7.5~7.8），电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。表1常用的琼脂糖凝胶电泳缓冲液缓冲液工作溶液贮存液（1000ml）Tris-乙酸（TAE）1×∶0.04mol/LTris-乙酸0.001mol/LEDTA50×:242gTris57.1ml冰乙酸100ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）Tris-磷酸（TPE）1×∶0.09mol/LTris-磷酸0.002mol/LEDTA10×:108gTris15.5ml85%磷酸（1.679g/ml）40ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）Tris-硼酸（TBE）0.5×∶0.045mol/LTris-硼酸0.001mol/LEDTA5×:54gTris27.5g硼酸20ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）（3）琼脂糖凝胶的制备胶液的制备：称取适量的琼脂糖，置于锥形瓶中，按所需的凝胶浓度加入电泳缓冲液，溶化，摇匀，待溶液冷却到一定温度。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。表2琼脂糖凝胶浓度与分辨DNA大小范围的关系琼脂糖凝胶浓度/（%）可分辨的线性DNA大小范围/（kb）0.360~50.620~10.710~0.80.97~0.51.26~0.41.54~0.22.03~0.1胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg/mL。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入已稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲溶解液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料与10~15%蔗糖或10~15%甘油，以增加其比重，使样品集中。用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换移液枪头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。（4）样品的配制和加样加完样后,合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压和电流。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的