发酵过程多尺度优化案例分析(郭美锦)

发酵过程多尺度优化案例郭美锦华东理工大学中国上海青霉素发酵曲线基因工程菌红霉素发酵曲线303-09-433批基因工程菌代谢过程曲线(接种量10.7%)发酵中期（70-90h）随着补糖速率的快速上升，RQ上升，OUR、CER出现第二高峰，即“二次生长”。阿维菌素发酵过程曲线发酵过程优化与放大是一个令人困惑的问题？背景直接参数物理参数化学参数温度压力功率输入通气流量泡沫水平加料速率基质前体诱导物培养液重量培养液体积生物热培养液表观粘度积累消耗量基质酸碱消泡剂细胞量气泡含量气泡表面积表面张力pH氧化还原电位溶解氧浓度溶解CO2浓度排气O2分压排气CO2分压其他排气成分成分浓度糖氮前体诱导物产物中间代谢物金属离子脱氢酶活力各种酶活力细胞内成分蛋白质DNARNA成熟不成熟搅拌间接参数摄氧率（OUR）二氧化碳生成率（CER）呼吸商（RQ）总氧利用体积氧传递系数（KLa）细胞浓度（X）细胞生长速率（Rx）比生长速率（μ）细胞得率（YX/S）糖利用率氧利用率比基质消耗率（u）前体利用率产物量（P）比生产率（υ）其他需要计算的值参数功率、功率准数雷诺数细胞量生物热碳平衡能量平衡生理参数案例分析:多拷贝毕赤酵母发酵•毕赤酵母（Pichiapastoris）•猪胰岛素前体(Porcineinsulinprecursor,PIP)毕赤酵母研究背景毕赤酵母简介：经过二十多年的发展，毕赤酵母表达系统已发展成为外源蛋白表达最常用的表达系统之一，已有超过五百种蛋白在该系统中成功表达。毕赤酵母表达系统特点：真核系统受甲醇严格调控的强启动子（PAOX1，PGAP，PFLD等）成熟的高密度培养技术高外源蛋白表达量（无论是胞内还是胞外表达）外源蛋白基因遗传高稳定性重组蛋白表达策略高密度防蛋白降解分泌效率翻译效率转录水平高拷贝数高表达TypicalprofilesofPichiapastoriswithMutStype工程植酸酶发酵过程特征跨尺度关联分析（1）：不同碳源图3葡萄糖为碳源时生长阶段发酵过程曲线图图4甘油为碳源时生长阶段发酵过程曲线图图葡萄糖为碳源时生长阶段发酵过程曲线图图甘油为碳源时生长阶段发酵过程曲线图PART1:r-Phytase工程植酸酶发酵过程特征跨尺度关联分析（2）：不同阶段图发酵不同时期RQ值PART1:r-Phytase图7甘油为碳源时过渡阶段发酵过程OUR和DO曲线图8葡萄糖为碳源生长时过渡阶段发酵过程OUR和DO曲线图甘油为碳源时过渡阶段发酵过程OUR和DO图葡萄糖为碳源生长时过渡阶段OUR和DO曲线工程植酸酶发酵过程特征跨尺度关联分析（3）：不同碳源启动时间PART1:r-Phytase工程植酸酶发酵过程特征跨尺度关联分析（4）：启动时间与强度PART1:r-PhytasePAOXActivationStartinductionOUR/CERincreasehere诱导阶段主要代谢途径关键酶酶学过程在线参数综合分析糖酵解途径中关键酶丙酮酸脱氢酶复合体（PDC）的活性三羧酸循环中的关键酶异柠檬酸脱氢酶（IDE）活性HMP途径中的关键酶6-P-葡萄糖脱氢酶(G-6-P)活性甲醇完全氧化代谢的甲醛脱氢酶(FAD)、AOX的活性呈下降趋势（RQ：0.75）呈上升趋势（RQ：0.75+0.5）6.1倍、2.5倍2.4倍、5.1倍甲醇浓度与、蛋白表达的关系00.20.40.60.811.20246810t/h乙醇氧化酶甲醛脱氢酶植酸酶活性植酸酶表达速率甲醇浓度甲醇消耗速率•PAOX1强度与甲醇浓度关系：0.75g/L•PAOX1启动与表达关系：启动应有一定强度（过渡阶段）表达速率才能提高•过高甲醇浓度的影响：过高引起表达速率下降，同时加强甲醇完全氧化途径，浪费能量多拷贝基因菌株发酵过程特点图生长阶段与表达阶段的耗氧比较低拷贝基因菌株与高拷贝基因菌株发酵比较高拷贝菌株PIP2.0-1发酵过程图低拷贝菌株YP99的发酵过程图重组蛋白表达策略高密度防蛋白降解分泌效率翻译效率转录水平高拷贝数高表达拷贝数对外源蛋白表达的影响——正效应CLARE,J.J.etal（1991）aMansur,M.etal（2005）Vassileva.etal（2001）Clare,JJ.etal（1991）b胞内表达分泌表达Hohenblum,H.etal（2004）Cos,O.etal（2005）Inan,M.etal（2006）30+30+拷贝数拷贝数对外源蛋白表达的影响——负效应如何优化高拷贝数毕赤酵母菌外源蛋白表达策略？外源基因拷贝数外源蛋白产量甲醇利用降低、生长缓慢Cosetal2005死亡率升高Hohenblumetal2004外源蛋白折叠分泌能力下降Hohenblumetal2004;Inanetal2006基因水平反应器水平毕赤酵母生理细胞水平高拷贝菌株构建6copy29copy重组毕赤酵母生长与表达0102030405060708090100110050100150200250300350400OD600fermentationtime(h)1-copy6-copy12-copy18-copy0102030405060700100200300400500600700800PIP(mg/L)inductiontime(h)1-copy6-copy12-copy18-copy多拷贝重组菌OUR比较0102030405060708090100110020406080100120140160180200010203040506070809010011002040608010012014016018020001020304050607080901001100204060801001201401601802000102030405060708090100110020406080100120140160180200OUR,CER(mmol.L-1.h-1)fermentationtime(h)CEROURRQ补料诱导1-copy-1.0-0.8-0.6-0.4-0.20.00.20.40.60.81.01.2RQ诱导补料RQOUR,CER(mmol.L-1.h-1)fermentationtime(h)CEROURRQ-1.0-0.8-0.6-0.4-0.20.00.20.40.60.81.01.26-copy补料诱导RQOUR,CER(mmol.L-1.h-1)fermentationtime(h)CEROURRQ-1.0-0.8-0.6-0.4-0.20.00.20.40.60.81.01.212-copy补料诱导RQOUR,CER(mmol.L-1.h-1)fermentationtime(h)CEROURRQ-1.0-0.8-0.6-0.4-0.20.00.20.40.60.81.01.218-copy0102030405060708090100110020406080100120140160180200OUR(mmol.L-1.h-1)fermentationtime（h）1-copy6-copy12-copy18-copy补料诱导PIPAOX1FLD1DAKZWF1PYK2PDHGAPCIT1PDI1KAR2GLR1TRR1毕赤酵母在甲醇诱导时的代谢途径示意图H2O2，ROOH，·OHPIP外源基因PIP的转录差异分析PIP的转录水平增加与拷贝数成正比0.001.002.740.001.002.003.004.00G0G6A3relativeratiopip0618PIP1.001.433.140.001.002.003.004.00G0G6A3relativeratiopdi1.002.686.780.002.004.006.008.00G0G6A3relativeratiokar2PDI1KAR2蛋白伴侣基因的转录差异分析PIP蛋白的合成通量也随拷贝数的增加而增加了1.001.433.140.001.002.003.004.00G0G6A3relativeratiopdi06181.002.686.780.002.004.006.008.00G0G6A3relativeratiokar20618PIPGLR1TRR1抗氧化基因的转录差异分析高拷贝菌株可能受到氧化胁迫1.001.151.680.000.501.001.502.002.50G0G6A3relativeratioglr06181.001.081.750.000.501.001.502.002.50G0G6A3relativeratiotrr0618H2O2，ROOH，·OHROSGSHPIP活性氧（ROS）水平胞内ROS和GSH水平AOX1FLD1DAK甲醇代谢途径关键酶基因的转录差异分析高拷贝菌株甲醇代谢途径发生显著变化1.001.031.800.000.501.001.502.00G0G6A3relativeratiofld01861.001.101.130.000.501.001.50G0G6A3relativeratiodak0186PIP1.001.000.350.000.501.001.50G0G6A3relativeratioaox0186PIPZWF1PYK2PDHGAPCIT11.000.970.790.000.501.001.50G0G6A3relativeratiogap1.000.930.870.000.501.001.50G0G6A3relativeratiopyk1.000.930.850.000.501.001.50G0G6A3relativeratiozwf1.001.020.730.000.501.001.50G0G6A3relativeratiopdh1.000.800.950.000.501.001.50G0G6A3relativeratiocit中心代谢途径关键酶基因的转录差异分析AOX1PIPDAKCIT1ZWF1FLDPDHPYK2GAPGLR1TRR1PDI1KAR2ROSGSH低拷贝菌株关键酶转录水平变化（与空白菌比）1.433.14AOX1PIPDAKCIT1ZWF1FLDPDHPYK2GAPGLR1TRR1PDI1KAR2ROSGSH0.350.730.790.341.802.743.146.781.751.68高拷贝菌株关键酶转录水平变化（与空白菌比）氧化胁迫甲醇代谢显著变化高拷贝菌株中，甲醇代谢途径的变化，使得由于细胞合成的碳源和能源供应不足，因此细胞生长缓慢；同时也表明PIP蛋白的翻译可能是蛋白表达的限制性因素为什么高拷贝菌株中甲醇代谢途径发生变化？拷贝数对毕赤酵母生理代谢影响的转录差异分析拷贝数增加蛋白合成量增加蛋白氧化折叠通量增加胞内GSH大量消耗酵母代谢甲醛能力降低细胞调控通过降低甲醇通量来减少胞内甲醛积累细胞碳源能源供给不足（PDI1，KAR上升）（GSH水平下降）（ROS上升）（AOX1下降，FLD上升）甲醇-YE混合补料18-copy拷贝数对毕赤酵母生理代谢影响的转录差异分析AOX1PIPDAKCIT1ZWF1FLDPDHPYK2GAPTRR1PDI1KAR21.302.181.543.581.641.652.661.36GLR13.76YE补加后高拷贝菌株关键酶转录水平变化传感技术应用尾气在线质谱技术在线显微观察仪活细胞量在线测定技术原位红外光谱检测技术基于稳定同位素13C的细胞微观代谢通量检测技术总结•寻找关键生理参数•优化操作参数