发酵优化策略案例分析(20130324)

发酵过程优化技术案例分析—2个例子郭美锦华东理工大学背景直接参数物理参数化学参数温度压力功率输入通气流量泡沫水平加料速率基质前体诱导物培养液重量培养液体积生物热培养液表观粘度积累消耗量基质酸碱消泡剂细胞量气泡含量气泡表面积表面张力pH氧化还原电位溶解氧浓度溶解CO2浓度排气O2分压排气CO2分压其他排气成分成分浓度糖氮前体诱导物产物中间代谢物金属离子脱氢酶活力各种酶活力细胞内成分蛋白质DNARNA成熟不成熟搅拌间接参数摄氧率（OUR）二氧化碳生成率（CER）呼吸商（RQ）总氧利用体积氧传递系数（KLa）细胞浓度（X）细胞生长速率（Rx）比生长速率（μ）细胞得率（YX/S）糖利用率氧利用率比基质消耗率（u）前体利用率产物量（P）比生产率（υ）其他需要计算的值参数功率、功率准数雷诺数细胞量生物热碳平衡能量平衡生理参数宏观代谢多参数发现与提出问题研究分析过程宏观代谢变化建立经济高效的优化控制工艺工业发酵过程的宏观代谢流分析方法1底物代谢与宏观多参数变化2生理参数OURRQ与合成代谢3活菌体的QO2与纤维素酶产率4菌体形态变化与酶合成速率5传质特性、流体物性与生产气泡O2发酵液流体发酵罐流场菌团菌丝OUROTR5.4U/ml14.7U/ml发酵过程分析与优化是一个令人困惑的问题？案例1:红霉素过程优化基因组图谱Natbiotechnol.2007•红霉素染色体呈线形，长度约8Mb，红霉素合成的基因位于离染色体一端550kb～1.25Mb之间的700kb片段。红霉素生物合成基因簇全长约56kb，左侧以eryCI为终端，右侧以eryK为终端。红霉素生物合成基因簇eryAIIIeryAIIISeryAI•M1、M2、M5和M6中的酶域相同•M3中只有KS．AT和ACP，•M4中酶域最多，除KS、KR、AT和ACP外，还有脱水酶域(DH)和烯酰还原酶竣(ER)。•在DEBSI的N端还有一个负载域(1oadingdomain，LD)酰基载体蛋白合成酶(KS)酰基转移酶(AT)酮还原酶(KR)酰基载体蛋白(ACP)引物丙酰单体：2-甲基丙二酰C红霉素生物合成途径红霉素调控策略•引物:丙二酰CoA(Malonyl-CoA)•延伸因子:甲基丙二酰-CoA(methylmalonyl－CoA)葡萄糖:Acetyl-CoA[糖酵解(EMP)]脂肪酸:Acetyl-CoA\malonyl－CoA（降解）前体：正丙醇（n-propanol）•丙酰CoA+ATP+CO2+H2O甲基丙二酰-CoA+ADP+Pi•丙酰CoA+草酰乙酸甲基丙二酰-CoA+丙酮酸发酵优化策略产物合成代谢流强化策略其他发酵过程操作因子优化以宏观代谢流分析与控制为核心发酵过程动态优化与生理代谢差异研究C：前体：油流加策略C控制策略:限制N控制策略:严谨响应带放工艺空气流量控制基因工程策略氮源组成响应面分析图优化筛选配方发酵代谢流差异0102030405060024487296120144168192Cultivationtime(hour)OUR、CER(mmol/l.h)00.511.52RQOURRQCER复合营养因子010203040506070024487296120144168192216Time(hour)PMV(%)对照组OUR强化组红霉素合成代谢流强化策略策略1:因子优化优化代谢曲线比较C:油:正丙醇策略2:代谢强度OUR调控下的生理特性------小试研究与生产规模联动50L发酵罐发酵过程OUR变化与产素水平020004000600080001000012000024487296120144168192216Time(hour)红霉素（U/ml)◆50L发酵罐优化工艺■50L发酵罐对照组工艺▲140m3发酵罐优化工艺策略3:补料工艺、带放补水工艺生产罐典型发酵代谢趋势曲线原带放补水工艺与优化工艺代谢曲线前期OUR代谢强度可作为跨尺度操作的调控因子代谢曲线一策略4:初级代谢向次级代谢转化调控(p)ppGppStringentResponseStringentResponse(StringentResponse(严谨响应严谨响应))策略策略5:5:组分优化为目标的基因改造组分优化为目标的基因改造目标：提高目标：提高红霉素红霉素AA含量含量，提高，提高产量产量红霉素A红霉素B红霉素D红霉素CEryKEryKEryGEryG1134563－强化红霉素基因合成簇表达4－强化丙酸激酶表达5－强化甲基丙二酰CoA变位酶表达6－调控丙酰CoA羧化酶表达7－强化ppGpp合成酶表达强化羟基化酶和甲基化酶表达提高红霉素A产量ACBZL1004,ZL1007：去除了副产物（红霉素B、C）产量提高25％¾ChenY,etal.AppEnvironMicrobiol2008,74:1820红霉素基因工程菌大规模发酵高产低杂质发酵高产低杂质发酵BB、、CC组分组分：：33--7%7%→→1.5%1.5%生产水平：生产水平：40004000→→9000U/ml9000U/ml优化(多尺度关联分析）放大（流场与生理）„B、C组分（杂质）去除的基因工程改造„生产水平严重下降(8000→→4000U/ml)4000U/ml)„系统生物学问题（120m3）0102030405060024487296120144168192216Time(hour)OUR、CER（mol/m3.h)00.40.81.21.62RQCEROURRQ计算流体力学（计算流体力学（CFDCFD）模拟：温度、浓度、）模拟：温度、浓度、剪切、剪切、……等流场等流场372m3试验发酵罐„50L→372m3„6500→9000U/ml生理特性验证372m3高耗氧搅拌发酵罐（国际上未见报道）高吨位红霉素工业发酵罐放大流场验证流场验证Case2毕赤酵母高密度发酵毕赤酵母研究背景毕赤酵母简介：¾经过二十多年的发展，毕赤酵母表达系统已发展成为外源蛋白表达最常用的表达系统之一，已有超过五百种蛋白在该系统中成功表达。毕赤酵母表达系统特点：¾真核系统¾受甲醇严格调控的强启动子（PAOX1，PGAP，PFLD等）¾成熟的高密度培养技术¾高外源蛋白表达量（无论是胞内还是胞外表达）¾外源蛋白基因遗传高稳定性毕赤酵母发酵过程分为三个阶段：•细胞生长阶段质(以甘油为唯一碳源)•外源蛋白表达阶段(以甲醇为唯一碳源)•过渡阶段生长相甲醇诱导相毕赤酵母发酵过程过渡阶段•碳源：葡萄糖甲醇•代谢途径迁移：EMP、TCA和HMP甲醇完全氧化和TCA、HMP、EMP•培养环境变化：如pH5.54.5毕赤酵母发酵过程控制策略1细胞生长阶段：高密度培养策略•分批发酵：低糖浓度，以防产生葡萄糖效应•补料发酵：补料策略9维持DO(20%)9维持葡萄糖浓度(0.1g/L)9维持比生长速率(µ)9经验补料速率发酵全过程曲线图分批培养补料培养毕赤酵母发酵过程控制策略2发酵过渡阶段控制策略•pH调控：充分利用糖代谢的原理•饥饿的重要：约30—60min•甲醇补料速率控制：低速率，如1.0g/L.h•过渡成功的判断：时间约1.0-3.0hDO明显下降OUR明显上升稍后pH开始下降或补甲醇过渡阶段重组蛋白表达策略高密度防蛋白降解分泌效率翻译效率转录水平高拷贝数高表达拷贝数对外源蛋白表达的影响——正效应CLARE,J.J.etal（1991）aMansur,M.etal（2005）Vassileva.etal（2001）Clare,JJ.etal（1991）b胞内表达分泌表达Hohenblum,H.etal（2004）Cos,O.etal（2005）Inan,M.etal（2006）30+30+拷贝数拷贝数对外源蛋白表达的影响——负效应如何优化高拷贝数毕赤酵母菌外源蛋白表达策略？外源基因拷贝数外源基因拷贝数外源蛋白产量外源蛋白产量zz甲醇利用降低、生长缓慢甲醇利用降低、生长缓慢Cosetal2005zz死亡率升高死亡率升高Hohenblumetal2004z外源蛋白折叠分泌能力下降Hohenblumetal2004;Inanetal2006基因水平基因水平反应器水平反应器水平毕赤酵母生理毕赤酵母生理细胞水平细胞水平高拷贝菌株构建6copy29copy重组毕赤酵母生长与表达0102030405060708090100110050100150200250300350400OD600fermentationtime(h)1-copy6-copy12-copy18-copy0102030405060700100200300400500600700800PIP(mg/L)inductiontime(h)1-copy6-copy12-copy18-copy多拷贝重组菌OUR比较0102030405060708090100110020406080100120140160180200010203040506070809010011002040608010012014016018020001020304050607080901001100204060801001201401601802000102030405060708090100110020406080100120140160180200OUR,CER(mmol.L-1.h-1)fermentationtime(h)CEROURRQ补料诱导1-copy-1.0-0.8-0.6-0.4-0.20.00.20.40.60.81.01.2RQ诱导补料RQOUR,CER(mmol.L-1.h-1)fermentationtime(h)CEROURRQ-1.0-0.8-0.6-0.4-0.20.00.20.40.60.81.01.26-copy补料诱导RQOUR,CER(mmol.L-1.h-1)fermentationtime(h)CEROURRQ-1.0-0.8-0.6-0.4-0.20.00.20.40.60.81.01.212-copy补料诱导RQOUR,CER(mmol.L-1.h-1)fermentationtime(h)CEROURRQ-1.0-0.8-0.6-0.4-0.20.00.20.40.60.81.01.218-copy010203040506070809010011020406080100120140160180200OUR(mmol.L-1.h-1)fermentationtime(h)1-copy6-copy12-copy18-copy补料诱导PIPPIPAOX1AOX1FLD1FLD1DAKDAKZWF1ZWF1PYK2PYK2PDHPDHGAPGAPCIT1CIT1PDI1PDI1KAR2KAR2GLR1GLR1TRR1TRR1毕赤酵母在甲醇诱导时的代谢途径示意图H2O2，ROOH，·OHPIPPIP外源基因PIP的转录差异分析PIP的转录水平增加与拷贝数成正比0.001.002.740.001.002.003.004.00G0G6A3relativeratiopip0618PIPPIP1.001.433.140.001.002.003.004.00G0G6A3relativeratiopdi1.002.686.780.002.004.006.008.00G0G6A3relativeratiokar2PDI1PDI1KAR2KAR2蛋白伴侣基因的转录差异分析PIP蛋白的合成通量也随拷贝数的增加而增加了1.001.433.140.001.002.003.004.00G0G6A3relativeratiopdi06181.002.686.780.002.004.006.008.00G0G6A3relativeratiokar20618PIPPIPGLR1GLR1TRR1TRR1抗氧化基因的转录差异分析高拷贝菌株可能受到氧化胁迫1.001.151.680.000.501.001.502.002.50G0G6A3relativeratioglr06181.001.081.750.000.501.001.502.002.50G0