细胞生物实验设计-细胞融合

一、实验目的1.了解聚乙二醇PEG诱导细胞融合的原理与技术2.学习并了解细胞融合技术二、实验原理细胞融合又称细胞杂交，是指两个或两个以上的细胞合并成一个细胞的现象。细胞融合技术是细胞工程骨干技术，除了用于一些基础性研究外，在植物方面主要用于合成新药，在动物方面主要用于产生单克隆抗体。诱导细胞融合的因素主要有三类：生物因数，物理因数，化学因素。本实验主要应用化学因数PEG诱导细胞融合。聚乙二醇PEG结构为HOH2C（CH2OCH2）nCH2OH，相对分子质量在200~6000。PEG能够改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。三、实验材料与器械胃粘膜上皮细胞，脐血干细胞20ml离心管若干，试管若干，50%聚乙二醇，PKH26染料，RPIM1640完全培养基，无血清培养基，完全培养基，低俗离心机，恒温水浴锅，96孔板，荧光显微镜四、实验步骤（一）1.胃粘膜上皮细胞洗涤后去除消化酶，制备成单细胞悬液，在室温下进行试验2.将处理后的细胞置于离心管中，添加适当无血清培养洗涤，400rpm离心5min3.去除上清液，残留液量25ul，用1mlDiluentC重悬细胞4.将细胞悬液与1mlPKH26染料迅速混合5.25℃培养2~5min，期间轻轻颠倒试管数次6.加入2ml兼容蛋白液（1%BSA）培养1min，终止染色7.加入4ml完全培养基，25℃,400rpm离心5min8.去除上清后将细胞移至新的离心管内再洗涤细胞三次9.用完全培养基洗涤细胞，离心后调节至所需细胞浓度10.按照实验步骤1~9方法处理脐血干细胞（二）1.将处理后的胃粘膜上皮细胞和脐血干细胞溶液加入5mlPBS混合均匀，吹悬2.室温下400rpm离心5min，去掉大部分上清液，留下0.1ml液体将沉降的细胞分散与其中，制成细胞悬液3.轻轻摇动试管，逐滴加入37℃下预热的50%聚乙二醇溶液0.4ml4.将此悬液置于37℃水浴中培育15s，缓慢的加入无血清培养液5ml，终止PEG的作用5.缓慢倾斜离心管4~5次，以1500rpm离心5min，去除大部分上清液，留下0.1ml液体悬浮细胞6.加入5mlRPIM1640完全培养基，混匀后加入96孔板中培养7.12小时后倒置荧光显微镜下照相观察五、预计实验结果1.部分细胞发生融合