3D皮肤模型与化妆品体外科学评估

3D皮肤模型与化妆品体外科学评估21研究背景目录2构建3D皮肤模型3基于3D皮肤模型建立体外替代检测方法3研究背景第一部分化妆品种类繁多，科学评估是关键数据来源1：国家食品药品监督管理总局(CFDA)数据来源2:国家统计局（2015）超过67万件化妆品产品化妆品与皮肤的相互作用：安全与功效6传统化妆品毒理学检测项目化妆品安全技术规范所列检测项目原料普通化妆品（非特）特殊用途化妆品易接触眼睛类发用产品护肤类易接触眼睛类护肤品一般彩妆品眼部彩妆品护唇及唇部彩妆品。。。育发染发烫发脱毛美乳健美。。。急性经口毒性试验○急性经皮毒性试验○皮肤刺激性/腐蚀性试验○○○○○○○○○○○○○○○眼刺激性/腐蚀性试验○○○○皮肤变态反应○○○○○○○○皮肤光毒性试验○○○鼠伤寒沙门氏菌/回复突变试验○○○○○体外哺乳动物细胞染色体畸变试验○○○○○体外哺乳动物细胞基因突变试验○哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验体内哺乳动物细胞微核试验○睾丸生殖细胞染色体畸变试验○亚慢性经口毒性试验○亚慢性经皮毒性试验○致畸试验○慢性毒性/致癌性结合试验○化妆品安全技术规范（2015）动物实验不能满足评估需求•种属、个体差异造成动物实验不能反映人体结果，不科学•每年有大量动物被处死，不人道8国际体外替代检测发展先驱——3R理念WilliamM.S.RussellRexBurch19599国际体外替代检测方法的发展趋势毒性终点测试方法OECD接受状态皮肤刺激/腐蚀体外重组人体表皮模型-皮肤腐蚀OECD431*∆体外检测生物膜屏障试验-皮肤腐蚀OECD435*∆体外重组人体表皮模型-皮肤刺激性OECD439∆皮肤致敏直接肽反应试验(DPRA)OECD442c(2015)ARE-Nrf2荧光素酶试验法(KeratinoSens™)OECD442d(2015)人类细胞系激活试验(h-CLAT)OECD442e(2016)LuSens（角化细胞内ARE受体基因试验）待同行评议IL-8记录细胞试验（IL-8Lucassay）同行评议骨髓U937皮肤刺激性试验（U-SENS）同行评议过敏原基因组快速检测(GARD)试验方法待验证利用皮肤模型分析基因试验（TheSENS-ISassay）待验证外周血单核细胞衍生的树突状细胞(PBMDC);-重组人体表皮(RhE)中IL-18的效力试验;-过氧化物酶肽反应试验(PPRA);-表皮过敏化分析试验-EpiSensA-10毒性终点测试方法OECD接受状态眼刺激/腐蚀性牛角膜混浊和渗透性试验(BCOP)OECD437∆离体鸡眼试验(ICE)OECD438∆荧光毒漏出试验(FL)OECD460∆短期暴露试验(STE)OECD491(2015)重组人角膜上皮模型试验(RhCE)EpiOcular™角膜模型的眼刺激实验(EIT)SkinEthic™眼刺激实验(EIT)（提案）LabCyte角膜模型（验证中）OECD492(2015)微生理仪细胞传感器试验(CM)2010年提出草案角膜刺激性检测试验（OcularIrritection®）EURLECVAM审查三维（3D）半角膜模型蛞蝓粘膜刺激试验国际体外替代检测方法的发展趋势11毒性终点测试方法OECD接受状态皮肤吸收人类离体皮肤吸收试验OECD428*∆光毒性3T3中性红摄取试验重组人皮肤模型试验（开发中）OECD432*∆遗传毒性/致突变细菌回复突变试验OECD471*∆体外哺乳动物染色体畸变试验OECD473*∆体外哺乳动物细胞微核试验OECD487*∆体外哺乳动物细胞Hprt和xprt基因突变试验OECD476(原1984年采纳的476于2015年被分为两个方法：476和490.)体外哺乳动物细胞胸苷激酶基因突变试验OECD490(2015)重组3D皮肤模型的微核试验和彗星试验计划2016年完成验证。人类表皮模型的微核试验计划2016年提交法规认可申请。国际体外替代检测方法的发展趋势……欧盟法规《EC1223/2009》规定：2009年立法禁止化妆品动物实验和禁止销售经过动物实验的化妆品原料2013年3月11日起全面实施欧盟率先立法全面禁止动物实验其他国家相继立法禁止动物实验欧盟*以色列*印度*新西兰加拿大美国巴西澳大利亚韩国阿根廷中国日本俄罗斯中国台湾实施化妆品动物试验/销售禁令的市场（*全面禁止）积极开展“终止动物残忍”活动的国家着手立案化妆品动物试验/销售禁令的市场《Rule148-C》《动物福利修正法案》《终止残忍化妆品法案》《道德的化妆品法案》《动物试验法》EC1223引自HSI14中国亟待发展体外替代检测体系化妆品进出口贸易技术壁垒中国化妆品产业发展与技术升级新检测技术体系与市场的发展消费升级与消费安全的有力保障社会经济的发展与动物福利保护法规与标准的发展建立国家竞争力15化妆品新原料/配方传统方法新技术新模型体外检测方法•皮肤细胞培养•3D模型构建•器官芯片技术•化学风险评估•微生物风险评估•动物毒理评估•基因水平•蛋白水平•细胞组织水平人体评估化妆品体外科学评估体外替代检测是中国化妆品产业发展的技术支撑16构建3D皮肤模型第二部分3D表皮模型EpiKutis含毛囊皮肤模型FolliKutis3D全层皮肤模型FulKutis含血管皮肤模型EndoKutis3D黑素皮肤模型MelaKutis含脂肪皮肤模型AdipoKutis3D角膜上皮模型BioOcullar3D口腔上皮模型EpiOriis完成系列化3D重组模型的开发结构与中国人皮肤高度一致，测试与临床结果高度一致成功开发国际第一个中国人3D皮肤模型3D皮肤模型：EpiKutis人体皮肤3D皮肤模型（EpiKutis）高度接近于天然皮肤H&ELORFLGCK10使用中国人角质形成细胞为种子细胞具有正常皮肤组织学结构、表达早期分化蛋白（CK10）晚期分化蛋白（FLG、LOR）实现3D皮肤模型（EpiKutis）的规模产业化攻克3D皮肤模型大规模、标准化生产的国际难题建成中国领先的3D皮肤模型产业化平台大规模细胞培养大规模3D组织构建发生器21基于3D重组模型建立体外替代检测方法第三部分22利用3D皮肤模型获取多维度测试数据基因表达组织结构细胞因子组织活力体外皮肤刺激性检测24体外皮肤刺激性检测体系Marker:药物曝露后的组织活力;Model:3D重组皮肤模型(EpiKutis);Method:MTT组织活力检测;3min30min2hrs4hrs8hrs16hrs24hrs腐蚀性重度刺激性中等刺激性轻微刺激或无刺激性OECD439GHS2OECD431GHS1EPAIEPAIIEPAIIIEPAIV药物曝露时间与刺激性强弱关系Timetotoxicity25基于3D皮肤模型皮肤刺激性（SIT）的检测流程给药DPBS清洗以阴性对照为100%计算组织活力值给药组OD%=阴性对照OD异丙醇浸提酶标仪读数FollowedOECDTG439后孵育26多时间点暴露（）ExposurewithmultitimepointsFollowTime-to-Toxicity（ET50）ViabilityispresentedrelativetonegativecontroltissuevaluesTestMaterialOD%=NegativeControlOD清洗WashoffMTT反应MTTreactionOD值读取ODreading化妆品的微弱刺激性检测方法（Time-to-Toxicity）SIT法不适用于判定化妆品的微弱刺激性SITisnotgoodenoughtopredicttheweaknessofskinirritation体外皮肤刺激性（Time-to-Toxicity）方法能有效判断化妆品配方的微弱刺激性体外皮肤刺激性（Time-to-Toxicity）方法在防腐体系筛选中的作用样品编号ET50（h）HSY-1ET50=11hHSY-2ET5024hHSY-3ET50=12h三个配方很接近，但是防腐体系不一样！防腐体系1：0.6%（苯氧乙醇+乙基己基甘油）+40%甘油防腐体系2：0.35%辛甘醇+40%甘油防腐体系3：0.6%苯氧乙醇+40%甘油防腐体系4：0.2%苯甲酸钠+40%甘油防腐体系5：0.6%（苯氧乙醇+乙基己基甘油）+0.35%辛甘醇+40%甘油防腐体系6：0.6%苯氧乙醇+0.2%苯甲酸钠+40%甘油防腐体系7：40%甘油体外皮肤屏障功效检测30消除炎症级联反应removetheinflammationcascade31皮肤角质细胞形态与皮肤屏障及肌肤敏感状态高度相关CorneocyteishighlyrelatedtoskinbarrierfunctionrCE60%rCE30%Basingonover5000casesofcorneocytemorphologyanalysis(Tape-stripping),ascomparedwithconsumerevaluation.RigidCorneocyteSample：TapeStripping/BioCellR&Ddata32NativeskinHDdermatitisThelowerceramide(EOS)andhigherFFAmayexplaindecreasedskinbarrierfunctioninHDDpatients.Sample：TapeStripping/BioCellDATAMethod：HPLC-ELSD皮肤屏障脂质（CER）与皮肤屏障及肌肤敏感状态高度相关Ceramideishighlyrelatedtoskinbarrierfunction33ProliferatingkeratinocytesEarlydifferentiatingkeratinocytesLatedifferentiatingkeratinocytesCornifiedkeratinocytesLipidsynthesisFilaggrinsynthesisLipidextrusionFilaggrincrosslinkSkinbarrier(Permeability):LipidandNMFSkinbarrier(Physical):CE,Celladhesion…Desmo-someInvolucrinsynthesisCorneodesmosomeLoricrinsynthesis皮肤屏障的构成与指标确定DeterminationofskinbarrierrelatedbiomarkersCornifiedEnvelopeSkinLipidCellJunctionCytoskeletonOthers□Filaggrin□HMG-CoAreductase□Occludin□Keratin1□Aquaporin3□Loricrin□Acetyl-CoAcarboxylase□Claudin1□Claudin4/7□Keratin5□Caspase14□Involucrin□Serinepalmitoyltransferase□ZO-1□ZO-2□ZO-3□Keratin10□Fas□Transglutaminase1□ABCA12□JAM-1□Keratin14□FasL□Transglutaminase3□PPAR-α□Desmoglein1□Keratin16□Caspase8□Transglutaminase5□PPAR-ss□Desmocollin1□Keratin17□IL-1α□Small-proline-richprotein2A□PPAR-δ□E-cadherin□Keratin2□IL-6□ABCA1□Gapjunctionprotein,alpha1□Keratin6□IL-8□Integrinalpha3/6;beta4/5□Keratin11□TNFα确定了200多种与皮肤屏障高度相关的基因34NoYesYesNoYesNoYesSampleRequestMTTIC50/Proliferation/Morph