第09章-疏水层析

第二部分分离技术生物活性分子的分离与表征第3章、沉淀法第4章、吸附层析第5章、纸层析第6章、凝胶过滤层析第7章、离子交换层析第8章、亲和层析第9章、疏水层析第9章疏水层析HydrophobicInteractionChromatography9.1、概述9.2、疏水层析原理9.3、疏水层析介质9.4、疏水层析实验技术9.5、疏水层析的应用9.6、反相层析9.1、概述疏水层析（HIC）亦称为疏水作用层析，是利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离的层析技术。从作用机制来看，它属于吸附层析。非极性化合物例如苯、环己烷在水中的溶解度非常小，与水混合时会形成互不相溶的两相，即非极性分子有离开水相进入非极性相的趋势，即所谓的疏水性(Hydrophobicity)。非极性溶质与水溶剂的相互作用则称为疏水效应(Hydrophobiceffect)。疏水效应疏水作用(hydrophobicinteraction):非极性分子进入水中，有聚集在一起形成最小疏水面积的趋势，保持这些非极性分子聚集在一起的作用则称为疏水作用。对于可溶蛋白，溶剂是水，疏水侧链因此被包埋在蛋白质内部。最终的结构是最适合周围溶液的热动力学折衷的结果。就球形蛋白质的结构而言，其分子中的疏水性残基数是从外向内逐步增加的。虽然疏水氨基酸大多被包埋在球形蛋白内部，有些则暴露在外，在蛋白质表面形成疏水区域，这部分暴露在外疏水性基团称为疏水补丁。疏水和亲水部件表面的溶菌酶。最疏水部分是深红色,浅红色的更少的疏水性。最亲水部分显示在深蓝色的,更少的亲水部分是浅蓝色。高度规则的水壳层包围在配基和蛋白的疏水表面周围。疏水物质被迫融合以减少这种壳的总面积（熵最大）。在纯水中，任何疏水效应都太弱而不能导致配基和蛋白之间或蛋白自身的相互作用。盐能够增强疏水作用。A)9.2、疏水层析原理B)亲水性强的蛋白质与疏水性固定相结合作用原理靠蛋白质表面的一些疏水补丁(hydrophobicpatch)；令蛋白质发生局部变性(可逆变性较理想)，暴露出掩藏于分子内的疏水性残基；高盐作用。疏水层析的特性所致，即在高盐浓度下，暴露于分子表面的疏水性残基才能与疏水性固定相作用。一般在lmol／L(NH4)2SO4或2mol／LNaCl高浓度盐溶液中，亲水性较强的组分物质，会发生局部可逆性变性，并能被迫与疏水的固定相结合在一起。然后通过降低流动相的离子强度，即可将结合于固定相的物质，按其结合能力大小，依次进行解吸附。也就是：疏水作用弱(即亲水性强)的物质，用高浓度盐溶液洗脱时，会先被洗下来。当盐溶液浓度降低时，疏水作用强的物质才会随后被洗下来。（相同盐浓度下，疏水作用弱的物质先被洗下来，疏水作用强的物质随后被洗下来）对于疏水性很强的物质，则需要在流动相添加适量有机溶剂降低极性才能达到解吸附的目的。疏水层析介质由基质和配体(疏水性基团)两部分构成。基质主要有多糖类如琼脂糖、纤维素和人工合成聚合物类如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯类。其中，琼脂糖类凝胶仍是应用最广泛的疏水介质。9.3、疏水层析介质HIC介质的疏水配基主要为烷基和芳香基，其烷基通常在C8以下，芳香基多为苯基。R代表疏水配基，M代表基质。调节两种反应物的比例可控制介质的配基密度（A）丁基（B）辛基（C）苯基（D）新戊基偶联至基质的常见配基类型对某些蛋白而言，上述有些配基与其结合力太强，洗脱有时需用有机溶剂，有变性风险；具中等疏水的高分子配基(如聚乙二醇和聚丙三醇等)不仅可提供足够的结合力，且避免了上述缺点。常用商品化疏水层析介质1.ButylSepharose4FastFlow工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14，工作的最大速度是600cm/h,配基结合量为每ml50μmol正丁烷基，疏水性最弱，适合含脂族配体的生物分子。2.OctylSepharose4FastFlow工作pH范围为3-13,清洗pH范围为2-14,工作的最大速度是600cm/h,配基结合量为每ml50μmol正辛烷基，疏水性中等，适合各种蛋白的分离和纯化。⒊PhenylSepharose6FastFlow工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14，工作的最大速度是600cm/h配基结合量为每ml40μmol苯基Phenyl，疏水性最强，载量高，适合含芳香族配体的生物分子的预处理，一、层析柱的制备1、层析介质选择配基的性质与密度对决定疏水相互作用层析介质最终的选择性、结合能力起到重要的作用。9.4、疏水层析实验技术配基的种类和目的蛋白的性质在确定疏水相互作用层析的选择性方面是高度显著的参数。最合适的配基必须通过用目的蛋白进行筛选试验来确定。图21在使用一种苯基配基、同样的运行条件下三种单克隆抗体相互作用不同。总的来说，疏水相互作用填料可以根据它们和样品组分的相互作用分为两类。直链烷基（丁基，辛基，醚基，异丙基）显示一个纯的疏水性质，而芳香基配基（苯基）显示混合型性质，包括芳香性和疏水性相互作用。在进行常压疏水层析时，大多数是选用苯基(或辛基)-SepharoseCL-4B吸附剂作固定相。2、层析柱的选择柱床高度通常为5～15cm。对一个优化好的分离方案进行规模放大时，可保持柱高不变，增加柱的直径粗柱子（内径为1.6～5.0cm）适合进行HIC层析。3、装柱将选定的亲水性吸附剂如苯基-SepharoseCl-4B悬浮于乙醇溶液中，浸泡一段时间；采用离心(或过滤)方法，弃上清液，收集沉淀物；并以50％(m／V)浓度悬浮于样品缓冲液中；尔后，按常规方法装入层析柱，经洗涤、平衡完毕，即可加样。二、盐的选择在疏水相互作用层析中，结合过程比洗脱过程更具有选择性。所以，优化起始缓冲液的条件很重要。正确选择的盐种类和浓度是影响载量和最终选择性的最重要参数。往平衡的缓冲液和样品中加入一种盐析盐，有利于固定化配基与蛋白质的相互作用。随着盐浓度的提高，结合到固定化配基上的蛋白质量也相应提高。在实践中，钠、或铵的硫酸盐有效的促进在疏水相互作用层析中配基-蛋白相互作用，在蛋白质结构上有稳定作用。因此，最常用的盐：Na2SO4、NaCl和(NH4)2SO4。在给定的浓度下，和其它的盐相比，硫酸铵能够给出最好的分辨率，但在pH高于8.0的情况下不推荐使用。硫酸钠是一种非常好的盐析试剂，但是在高浓度下，蛋白稳定性的问题可能会阻碍它的应用。图22不同盐对选择性的影响：按顺序增大洗脱体积洗脱：细胞色素C、溶菌酶、核糖核酸酶A、α-糜蛋白酶原。如果目的分子洗脱得太晚或根本不洗脱，或者不能更换到不同的填料，尝试使用50%的盐浓度结合。有些蛋白在高盐浓度下开始沉淀。起始缓冲液中的盐浓度需要降低以避免在运行中的沉淀。重复的以小量上样也能帮助避免由于沉淀引起的产量丢失。图23起始溶液中的盐浓度影响选择性和分辨率。对于疏水相互作用，选择缓冲液离子并不致关重要。最经常使用磷酸缓冲液。pH的选择必须和蛋白稳定性和活力兼容。然而，在疏水相互作用层析过程中，pH5-8.5对于最终的选择性和分辨率的影响都非常小。pH的增加减弱疏水相互作用，在pH高于8.5或低于5的时候，蛋白的存留会更加显著的改变。三、缓冲液添加剂可以用来改善选择性和分辨率。例如，样品和疏水相互作用层析填料结合太紧时。然而，如果在高浓度使用，就有使目的蛋白失活或/和变性的可能。添加剂可以通过促进蛋白溶解性，改变蛋白构象，促进结合着的蛋白的洗脱来影响分离。水溶性醇、去垢剂等是疏水相互作用层析中最广泛使用的添加剂。四、层析步骤平衡↓上样↓平衡除杂↓洗脱34Equilibration1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionEquilibratethecolumnandadjustthesampletobindingconditionsHydrophobicligandGelmatrixWatermoleculesSampleapplication1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionGelmatrixProteinsHydrophobicgroupsWashingoutunboundmaterial1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionConc.saltAbsNon-boundproteinsElution1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionTargetelutesConc.saltAbsElutionConc.saltAbs1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionMorestronglyboundproteins加样在进行任何疏水相互作用层析前，需确定样品的“盐稳定范围”。比如，加入逐步增加的盐至粗提物中，用来确定蛋白沉淀发生的浓度。确认样品在上样到柱子时低于该盐浓度，以避免沉淀。样品制备：建立盐溶解性范围后，从最高的能够保持生物学活力而不发生沉淀问题的盐浓度开始。调节样品到起始缓冲液的盐浓度来促进疏水相互作用。使用高浓度的储液调节盐浓度，以避免由于加入固体盐时局部盐浓度过高而造成沉淀。直接调节样品的pH。由于疏水相互作用对pH不是非常敏感，不需要完全的缓冲液交换。在上样前用简单的步骤净化所有的样品，这样可以避免堵柱子的风险，减少强力清洗步骤的需要，避免柱子性能的破坏和柱压的增加。黏度随着温度而变化，在高盐浓度下会增加。样品的可溶性或黏度可能会影响柱子的上样量。高样品黏度导致畸变的流速样式，最终导致变宽的、破坏的峰和压力问题。稀释粘稠的样品。如果不能稀释，用更低些的盐浓度或具有更大颗粒大小的填料可能会帮助克服黏度问题。样品浓度通常应该不超过50毫克/毫升。保证样品，柱子，起始和洗脱缓冲液都在同样的温度。大多数条件下，增高温度会增强疏水相互作用，所以在更低的温度工作（通常低于10度）能够使由于疏水相互作用而导致的样品组分间的聚集最小化。降低温度可以作为通过加入去垢剂来提高可溶性的替代方案。洗脱（1）采用降低流动相中盐浓度的方式洗脱（最常用）。（2）通过往流动相中添加有机溶剂，如：乙二醇、丙醇、异丙醇等，降低流动相极性的方式洗脱（溶剂中稳定性良好的物质）。（3）往流动相中添加去污剂等，去污剂本身能与介质发生强烈吸附，从而将结合在其上的目标组分置换下来（分离膜蛋白）。五、HIC柱的再生、清洁和贮存轻度污染时，蒸馏水洗涤。污染物紧密结合时，先用6mol/L尿素或6mol/L盐酸胍洗涤，再用起始缓冲液或贮存缓冲液洗涤。NaOH可用于溶解变性和沉淀的蛋白质及脂类未使用的介质储存在封闭的容器中，在4-25℃的条件下保存。用过的介质应贮存在含有适当抑菌剂的溶液中，在4～8℃的条件下保存。9.5、疏水层析的应用1、多种生物大分子的分离纯化。2、去除DNA。在用基因工程生产的各种药物中,世界卫生组织(WHO)规定药物中DNA的残留量应低于100pg/ml。利用HIC纯化技术则可以有效地除去残留的DNA,因为在DNA的结构中几乎不存在疏水区域,因此难以和疏水色谱填料结合而被除去。3、一些脲变性或胍变性蛋白质的复性。将盐酸胍变性的牛血清白蛋白、溶菌酶、核糖核酸酶混合物通过HIC柱,30分钟内可获得除去变性剂、分离和完全复性三种功效。4、研究蛋白折叠机理。运用HIC技术可以对变性蛋白质复性过程中产生的中间体进行分离，通过对这些中间体的研究,可以了解蛋白质的折叠机理。实例1：从杂交瘤细胞培养液中浓缩并纯化单克隆抗体Sample:Hybridomacellculturesupernatant,mouseIgG1,anti-IgE.Ammoniumsulfateaddedto0.5MColumn:HiLoad16/10PhenylSepharoseHPStartb