酵母单杂交-实验方法

酵母单杂分析酵母单杂交技术是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法，通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因，或对结合位点进行分析。运用此技术能筛选到与DNA结合的蛋白质，并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列而无需复杂的蛋白质分离纯化操作，故在蛋白质研究中具有一定的优势；而且酵母属真核细胞，通过酵母系统得到的结果比其它体外技术获得的结果更能体现真核细胞内基因表达调控的情况。【实验目的】了解酵母单杂交的基本原理和应用，掌握酵母单杂交的主要步骤及注意事项，学会酵母感受态的制作与转化，基因文库的构建及筛选。【实验原理】酵母单杂交方法是根据DNA结合蛋白（即转录因子）与DNA顺式作用元件结合调控报告基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因（cDNA）。该方法也是细胞内分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效方法。如图所示，将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子（minimalpromoter，Pmin）上游，Pmin启动子下游连接报告基因。进行cDNA融合表达文库时，编码目的转录因子的cDNA融合表达载体被转化进入酵母细胞后，其编码产物（转录因子）与顺式作用元件结合，就可以激活Pmin启动子，并促使报告基因表达。根据报告基因的表达，筛选出与已知顺式元件结合的转录因子。cDNA文库筛选cDNA融合表达载体转录因子顺式元件顺式元件Pmin报告基因基因编码产物酵母细胞表达“MatchmakerGoldYeastOne-HybridLibraryScreeningSystem”提供了一个简单高效的构建cDNA文库并进行酵母单杂交筛选的方法，它使用aureobasidinA抗性基因作为报告基因，筛选效率高，背景低。单杂交筛选是从酵母双杂交筛选发展而来，利用单杂交筛选可以对cDNA文库进行筛选直接获得与目的顺式作用元件相结合的蛋白质。图2用MatchmakerGoldOne-HybridSystem筛选protein-DNA相互作用的原理TheMatchmakerGoldOne-HybridLibraryScreeningprocess主要包括以下步骤：1将已知序列（bait）克隆到pAbAi载体。2pBait-AbAi质粒转化Y1HGold酵母菌株，使其与酵母基因组发生重组，生成bait/reporter酵母菌株。3检测Y1HGoldbait菌株AbAir基因的本底表达水平。4合成cDNA并通过cDNA和pGADT7-Rec载体共转化酵母进行细胞内同源重组筛选cDNA文库。5筛选结果的验证和分析。【实验准备】1仪器设备微量取液器（2.5L；20L；50L；100L；200L；1000L）、PCR仪、低温离心机、台式离心机、CHROMASPINTM+TE-400纯化柱、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、恒温摇床、恒温孵箱、通风橱、制冰机、振荡器、恒温金属浴、酒精浴、无菌接种环、10cm培养皿、15cm培养皿等。2实验材料Y1HGold酵母株、TOP10大肠杆菌菌株、各种方法提取的RNA、pGADT7-Rec质粒和pBait-AbAi质粒等。3主要试剂（1）Advantage2PCR试剂盒、EasyYeastPlasmidIsolation试剂盒、MatchmakerInsertCheckPCRMix1、MatchmakerInsertCheckPCRMix2。（2）各种基础培养基和营养缺陷培养基：minimalSDbase，minimalSDagarbase，YPDmedium，YPDagarmedium，-LeuDOsupplement，-UraDOsupplement，腺苷酸（adenine），PEG8000，carringDNA，aureobasidinA，LB培养基，氨苄西林。（3）NaCl溶液（0.9%）、sodiumacetate（3mol/L）、50%PEG、10×LiAc（1mol/L）、10×TEbuffer、DTT（100mmol/L）、RNaseH、限制性内切酶。【实验方法】1pBait-AbAi载体的构建（酵母报道子的构建）注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到pAbAi载体AbAir报告基因的上游。大量研究表明最有效的构建应包含目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于长度小于20bp的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。（1）设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与pAbAi载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列作为对照，以排除可能的假阳性）。（2）用TEbuffer溶解寡核苷酸至终浓度100mol/L。（3）将正向链和反向链按照1:1的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度为50mol/L）。（4）95C保温30s，去除二级结构。（5）72C保温2min，37C保温2min，25C保温2min。注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。（6）冰上放置。退火后的产物可贮存在-20C冰箱备用。（7）酶切1LpAbAi载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。（8）将退火后的寡核苷酸稀释100倍至终浓度为0.5mol/L。（9）在连接反应管中加入如下成分：pAbAi载体（50ng/L）1.0Lannealedoligonucleotide（0.5mol/L）1.0L10×T4DNAligasebuffer1.5LBSA（10mg/mL）0.5LNuclease-freeH2O10.5LT4DNAligase（400U/L）0.5L总体积15L注：如果有必要，可用1Lnuclease-freeH2O代替寡核苷酸作为阴性对照。（10）将反应体系室温放置连接3h，转化Ecoli，采用常规方法检测阳性克隆。注：可用酶切或测序进行检测。2质粒转化酵母细胞，生成Bait-Reporter酵母菌株（图）图3Bait-Reporter酵母菌株生成原理示意图（1）用BstBI或者BbsI酶切2LpBait-AbAi，pMutant-AbAi，p53-AbAi质粒，使其在URA3基因处断开，纯化酶切产物。（2）按MatchmakerYeastTransformationSystem2的步骤用1l酶切后的质粒转化Y1HGold酵母。（3）稀释每个转化体系至1/10、1/100、1/1000，分别取每个稀释物均匀涂于SD/-Ura琼脂平板上。3d后挑取5个单克隆，用MatchmakerInsertCheckPCRMix1进行PCR检测阳性克隆，用Y1HGold的单克隆做阴性对照。（4）在PCR管中加25lPCR-gradeH2O。（5）用干净的枪头轻轻接触酵母单克隆，以获得非常少量的酵母细胞。将枪头伸进PCR-gradeH2O中搅拌，使酵母细胞散开。注：切忌挑取整个酵母单克隆，因为细胞过多会阻止PCR反应的进行。如果加入细胞后水变浑浊，证明加入了过多的酵母细胞。（6）向每个管中加入25lMatchmakerInsertCheckPCRMix，混匀，离心。每个PCR管中现已含有如下反应物：MatchmakerInsertCheckPCRMix25lH2O/yeast25l总体积50l（7）按下述程序进行PCR反应；95C1min98C10s55C30s30cycles68C2min（8）取5lPCR产物，用1%的琼脂糖凝胶电泳分析。注：引物与AbA基因以及URA3下游的Y1HGold基因组结合，扩增片段长约1.4kb。图4PCR检测pBait-AbAi的插入情况正确的PCR检测结果应是：阳性对照：1.4kb阴性对照：无条带诱饵菌株：1.35kb+insertsize（9）分别挑取PCR检测呈阳性的诱饵克隆和p53-AbAi对照克隆，在SD/-Ura平板上划线培养。30C孵育3d后，将平板置于4C保存，即为新构建的Y1HGold[Bait/AbAi]菌株和[p53/AbAi]对照菌株。（10）经过长期放置后，挑取单克隆在YPDA液体培养基中过夜培养，离心收集菌体，用1mL预冷培养基（100ml灭菌的YPDA与50ml灭菌的75%甘油混合）重悬菌体，速冻后与-70C保存。3检测诱饵菌株AbAr基因的表达在不存在捕获物的情况下，由于克隆到pAbAi载体中的诱饵序列不同，诱饵菌株报告基因的本底表达水平也不相同。例如：p53-AbAi对照的最低aureobasidinA抑制浓度为100ng/ml。注：酵母单杂交实验成功的前提是没有内源转录因子能够与目的序列结合或者结合能力非常弱。因此在进行文库筛选之前，检测所构建的诱饵菌株AbAr基因的表达情况十分重要。所以需要进行实验以确定进行文库筛选时抑制诱饵菌株报告基因本底表达所需的AbA浓度。（1）分别挑取诱饵克隆和对照克隆，用0.9%NaCl重悬细胞，调节A600到0.002（大约2000个细胞/100l）。（2）在下述培养基上分别涂布100l重悬后的菌液，30C培养2-3d。SD/-UraSD/-UrawithAbA（100ng/mL）SD/-UrawithAbA（150ng/mL）SD/-UrawithAbA（200ng/mL）预期结果如下所示：表1AbAr基因预期本底表达结果[AbA]/（ng/mL）Y1HGold[p53-AbAi]克隆数Y1HGold[pBait-AbAi]克隆数0约2000约20001000Baitdependent1500Baitdependent2000Baitdependent（3）在进行文库筛选时，使用AbA的浓度应为最低抑制浓度，或使用比最低抑制浓度稍高的AbA浓度（高约50-100ng/mL），以彻底抑制诱饵菌株的生长。注：如果200ng/mLAbA不能抑制本底表达，可以尝试提高AbA浓度至500-1000ng/mL。然而，在不存在捕获物的情况下，如果1000ng/mL的AbA浓度仍无法抑制AbAr基因的表达，那么很可能存在能够识别并与目的序列结合的内源调控因子，因而该目的序列无法用来进行酵母单杂交筛选。4文库cDNA的合成提取试材总RNA，进行反转录合成cDNA。合成的cDNA末端具有与pGADT7-Rec相同的酶切位点。（1）cDNA第一链的合成①准备高质量的polyA和/或总RNA，用humanplacentapolyA+RNA作为阳性对照。注：RNA的质量决定文库的质量，RNA应为所要研究的特定时期和特定组织的RNA。②在微量离心管中加入如下反应物：RNA模板（0.025-1.0gpolyA和/或0.10-2.0g总RNA）1-2lCDSIII（oligo-dT）orCDSIII/6（random）引物1.0lDeionizedH2O（使总体积达到4.0l）1-2l总体积4.0l在另外一支管中加入对照cDNA反应物，即RNA使用1l（1g）controlpolyA+RNA。③72C孵育2min。④冰上放置2min，轻轻混匀，立即加入步骤⑤中的试剂。⑤每一个反应加入如下试剂，轻轻混匀离心。5×first-strandbuffer2.0lDTT（100mmol/L）1.0ldNTPmixture（10mmol/L）1.0lSMARTM-MLVRT1.0l总体积5.0l注：步骤⑤中的试剂可在步骤②之前加好置于冰上。此步是cDNA合成的起始关键步骤，变性后的RNA/引物mix冰上放置的时间不应超过2min。⑥如果用的是CDSIII/6随机引物，25-30C保温10min。如果用的是CDSIII引物，省略此步，进行步骤⑦。⑦42C保温10min。⑧加入1lSMARTIIIoligo，充分混合，42C保温1h。⑨75C保温10min终止第一链的合成。⑩降至室温，加入1lRNaseH（2U）。11