分子诊断项目

分子诊断室项目介绍内容1.HBV-DNA荧光定量PCR2.流式基本应用3.染色体核型分析HBVDNA荧光定量PCR4PCR技术简介1985年美国PE-cetus公司的人类遗传研究室mullis等人发明了具有划时代意义的PCR技术，从而使人们梦寐以求的体外扩增核酸片段的愿望成为现实。1988年PE-cetus公司推出了第一台PCR热循环仪，从而使PCR技术的自动化成为现实。Mullis出因其卓越的贡献与寡核苷酸基因定点诱变的发明者Michael分享了1993年诺贝尔化学奖。随着PCR技术的日臻成熟1995年出现荧光基因探针杂交定量PCR方法5PCR基本原理类似DNA的体内复制，以单链DNA为模板，利用DNA聚合酶依赖于模板的特性，在附加的一对寡核苷酸引物之间催化合成互补链的过程。6DNA合成的必备要素DNAPolymerasedNTPssingle-strandedtemplateprimer7定量PCR概念以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，对PCR起始模板量的定量8常规PCR与定量PCR的比较常规PCR定量PCR反应方式2步法3步法2步法3步法反应液成分dNTP，引物，模板，酶dNTP，引物，模板，酶，探针，参照结果检测琼脂糖凝胶电泳ELISA，或实时荧光检测结果性质定性定量，或定性结果准确性无法区别假阴性、假阳性有效识别假阴性假阳性9实时荧光定量PCR原理指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。Ct（cyclethreshold)值定义：每个反应管的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。荧光阈值（threshold)的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10×SDcycle0-1510Ct值与起始模板的关系每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始模板数越多，Ct值越小，利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。11荧光定量的标准曲线标准曲线未知标本CrossingPoint(Cycles)log(copynumber)nlog(F2/F1)nlog(F2/F1)Target3812荧光检测模式（1）SYBRGreenI染料（2）水解探针（Taqman）（3）杂交探针（HybridizationProbes）（4）分子信标（molecularbeacon)发夹引物（sunriseprimer)蝎状引物（scorpionprimer)复合探针（complexprobes)13探针的5'端标记一个荧光基团，3'标记另一个荧光基团。5'端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端荧光淬灭基团（FRET），正常情况下检测不到该探针5'端荧光基团发出的荧光信号。Taqman探针原理14当溶液中模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，Taq酶沿模板向前合成子链，当延伸至探针结合处，发生链的置换；Taqman探针原理15Taqman探针原理Taq酶的5‘—3’外切酶活性将探针5‘端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3’端荧光淬灭基团的屏蔽，发出荧光，荧光信号与PCR产物的数量成比例。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。16定量PCR在乙肝检测中意义1.判断疾病的严重程度和传染性2.PCR结果与血清免疫学结果的综合评价3.观察抗病毒药物疗效，指导药物用量4.献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断5.预测病情、判断预后6.器官移植、母婴垂直传播17ＰＣＲ与乙肝标志物阳性率比较────────────────────────────────────例数HBsAgHBcIgGHBcIgMHBeAgHBeAbHBsAbPCR阳性率(％)────────────────────────────────────８６　　　＋　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３４３９.５３４５　＋　　　＋　　　　　　　　　　　　　　　　　１９４２.２２４２　　　　　　　＋　　　　　　　　　　　　　　　　　　５　１１.９０２８　　　＋　　　＋　　　＋　　　　　　　　　　　　　２７　９６.４３２９　　　＋　　　＋　　　　　　＋２９　１００１０＋　　＋１０　１００２８　＋　１　３.５７３７＋＋３８.１１１０＋００１０＋＋００────────────────────────────────────18标本留取及检测步骤标本：静脉血3ml，黄色盖试管。标本避免溶血和脂血。检测步骤：1.反应液配制2.核酸提取3.核酸扩增结果分析：采用样点拟合法，由标准曲线得到病毒的拷贝或IU/ML。191.分区操作：PCR具有超敏感性，因此在检测过程中应分区操作，即分为试剂准备区，样品处理区，PCR扩增区。2.试验前实验室应使用紫外消毒至少30分钟。3.操作时戴一次性手套，加样头要求及时更换，吸液时避免飞溅。注意事项204.每天实验前，在废物缸内套上塑料袋，加入半缸含有效氯1%次氯酸钠液，实验时将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。5.所有试剂试验前充分融化，避免反复冻融。6.每次PCR反应均应设立阴阳性对照。注意事项流式基本应用22流式细胞术的概念流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中的单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征23流式细胞仪的检测范围细胞结构细胞大小细胞颗粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体24散射光信号RightAngleLightDetectorCellComplexitySSCForwardLightDetectorCellSurfaceAreaFSCIncidentLightSource=前向角散射光（FSC,ForwardScatter）细胞相对大小及其表面积=侧向角散射光（SSC,SideScatter）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性25外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）26荧光信号使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量27数据分析数据显示:直方图(Histogram)二维点图(DotPlot)等高线图(ContourPlot)密度图(Density)三维图（3DPlot）28流式的临床应用=淋巴细胞亚群分析=白血病和淋巴瘤的免疫分型=肿瘤的细胞周期和倍体分析=网织红细胞计数=细胞移植的免疫状态监测=干细胞计数=阵发性血红蛋白尿=HLA-B27检查=血小板功能及相关疾病=HIV免疫分型，CD4绝对计数29淋巴细胞亚群分析使用经荧光素标记的特异单克隆抗体，进行多色染色，同时分析淋巴细胞膜上多种白细胞分化抗原（CD分子）的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定性分析各淋巴细胞亚群的百分含量淋巴细胞亚群的绝对计数，进行定量分析30根据功能，淋巴细胞主要分为B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病NK细胞（CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。31根据CD4、CD8表达，T淋巴细胞又分为T辅助/诱导细胞（CD3+CD4+），即Th/TiT抑制/细胞毒性细胞（CD3+CD8+）,即Ts/TcTh/Ts比值可用于评价自身免疫失调、被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态32临床意义诊断原发性免疫缺陷病（如先天性无r球蛋白血症）或继发性免疫缺陷病（如AIDS）造血干细胞移植后免疫重建（6个月NK；9个月T、B）Th/Ts：机体免疫功能亢进：自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎等（治疗有效恢复正常）Th/Ts：机体免疫功能低下：AIDS、病毒感染、慢性活动性肝炎和活动性肝硬化、再障、结核、肿瘤等33临床意义移植后动态免疫监测：急排临床症状出现前1-5天，活化T和Th/Ts持续，1.2预示急排；Th/Ts持续表明可能感染，比值1.08，可能性大，0.2应停用免疫抑制剂；实体肿瘤疗效和病人免疫状态观察治疗前常伴T、Th/Ts，放/化疗有效可恢复；淋巴细胞免疫表型正常或治疗后能恢复正常者预后常较好；探索疾病发病机理、进程和预后（炎症、肿瘤）34淋巴细胞亚群双色分析35先天性无r球蛋白血症36淋巴细胞亚群双色分析37HLA-B27☆HLA-B27是MHCI类抗原，在有核细胞上广泛表达HLA-B27的表达与强直性脊柱炎高度相关，超过90%的强直性脊柱炎患者HLA-B27阳性。其他，如Reiters综和症阳性率70-90%，银屑病性关节炎阳性率50-60%，葡萄膜炎阳性率40-50%☆检测采用全血，无需分离淋巴细胞，操作简单，可以快速、灵敏、准确地分析HLA-B27。☆结果报告检测的平均荧光强度，根据界值判定，得到阴性/阳性结果。实验的灵敏度为100%，特异性为97.5%。38流式细胞仪的应用（血液）白血病和淋巴瘤免疫分型造血干细胞计数阵发性血红蛋白尿（PNH）诊断网织红细胞计数血小板分析血小板膜糖蛋白分子的表达血小板活化网织血小板分析39流式细胞仪的应用（肿瘤）细胞周期和倍体分析肿瘤相关基因表达的研究抗肿瘤药物作用机制的研究放疗/化疗疗效的研究多药耐药基因的研究细胞凋亡的分析凋亡细胞的分析凋亡相关蛋白的分析40流式标本留取紫色盖试管，EDTA抗凝血或骨髓1-2ml。不能有凝块。单细胞悬液细胞数不少于106个。41染色体核型分析42基本概念染色体核型：指一个物种所特有的染色体数目和每一条染色体的形态特征。------人类体细胞中共有23对染色体，22对常染色体，一对性染色体。核型分析：将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特征分析的过程称核型分析。如正常女性核型：46,XX正常男性核型：46，XY。核型模式图：是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起来的图像。43染色体模式图44人类23对染色体4546染色体编号(人X染色体)记述一特定带时，需要写明4个内容：染色体号，长短臂，区的号序和带的号序。这些内容按顺序写，不用间隔或加标点。如果某一带被再细分，在原带号数后加一小数点，编号原则仍按从着丝粒往臂端序贯编号。如1p31.2代表一号染色体短臂3区1带第2亚带47染色体标本常规制备方法：中期染色体G带显色原理：采用秋水仙素处理培养的细胞，使细胞停留在分裂中期，再用低渗液处理细胞，使细胞胀大，以进行染色体制片。G-带是标本片经过预处理后，用Giemsa染色显示的带纹。48操作步骤细胞培养：细胞培养液5mL（含植物凝血素），加0.3mL肝素抗凝全血37℃培养箱静置培养68～72小时。收获细胞：终止培养前1～1.5小时加入秋水仙素。制片：低渗-预固定-固定-滴片-干燥老化G-显带，图像分析：胰酶消化，Giemsa染色，采集图像，分析20-30个中期分裂相49核型描述首先列出染色体总数，然后是性染色体组成，接着列出异常的染色体数目或形态。下列统一的命名符号：A-G染色体组的名称1-22染色体编号X,Y性染色体del缺失der结构重排的染色体dup重复inv倒位t易位+/-在染色体符号前表示染色体增加或减少，在染色体符号后表示染色体多出或缺少一部分50检查适应症及意义生殖功能障碍在不孕症、多发性