《基因工程》PPT课件

第四章基因工程一、基因工程诞生的背景1、理论上的三大发现①40年代发现了遗传物质—DNA1944、T·Avery肺炎双球菌的转化实验。②50年代搞清了遗传物质的分子机制—1953年WatsonandCrick的DNA结构：双螺旋、半保留复制，1958年诺贝尔奖。③60年代确立了遗传信息的传递方式—1961美国尼伦堡(Ninenberg)确立遗传信息以密码形式传递：3=1=1(3个核苷酸=1个密码子=1个Aa)1966年破译了64个密码,诞生了“密码字典”。2、技术上的三大发明①限制性内切酶的分离纯化1970H·Smith首次分离了Ⅱ型限制酶HindIII，1978年诺贝尔奖②基因克隆载体的应用1973Cohen用作载体③逆转录酶的发现1970BaltimoreandTemin同时发现—高速、超速离心技术—电泳技术—微量蛋白提纯技术—Aa顺序分析技术—基因合成技术—转化技术的建立—基因工程受体系统的发现1973年,美国斯坦福大学医学院遗传学家cohen完成了世界上第一个基因工程实验。Tc、Ne平板筛选表型：TcRNeR转化Cohen（科恩）模型二、基因工程的诞生三、基因工程的基本内容将外源基因（又称目的基因，是一段DNA片断）组合到载体DNA分子中去，再把它转到受体细胞（亦称寄主细胞）中去，使外源基因在寄主细胞中增殖和表达，从而得到期望的由这个外源基因所编码的蛋白质。供体细胞载体分子外源DNA外源基因分离酶切酶切连接转化扩增DNA重组分子受体细胞鉴定与表达重组转化子工程菌或细胞蛋白产物工程菌或细胞培养重组产物分离纯化基因工程基本流程示意图1、获得目的基因①化学合成法将新的dNTP加到DNA链的5‘羟基末端。②限制性内切酶法(鸟枪法,散弹法)用限制性内切酶降解染色体DNA,将降解的DNA片段克隆到载体上,从而获得目的基因。基因文库：把原核或真核生物细胞的染色体DNA切割一定大小的片段（一般20kb)，将它们与合适的载体（质粒，λ噬菌体）重新组合，转化或感染受体细胞，得到一大群重组体（克隆）在这一大群克隆中的每一个克隆中只含有基因组内的一个片段。这样的克隆群体就象储存有基因组内各种基因的仓库，故称基因文库。印迹法内切酶切开DNA电泳印迹转移放射性探针杂交胶片显影印迹法的主要步骤：（1）基因文库－DNA用限制性内切酶处理。（2）DNA片断混合物通过电泳分离。（3）电泳后，通过印迹技术转到酯酰纤维薄膜上，以便操作。（4）用已知小片断DNA作为探针，互补结合需要找的基因片断。（5）探针DNA片断已用放射性元素标记，使胶片感光后可看出。印迹法的关键是“分子杂交”，利用碱基配对的原则，用一段小的已知的DNA片断去寻找（“钓”）大的未知的基因片断。探针DNA片断从何而来？根据目的蛋白的氨基酸序列，只要其中N－端15－20个氨基酸序列，按三联密码转为40-60核苷酸序列，人工合成，即为探针DNA片断。③逆转录法获得真核生物目的基因先分离纯化目的基因的mRNA，将其逆转录成单链的DNA,再经过DNA聚合酶的作用产生双链的DNA，从而获得目的基因。2、目的基因的扩增聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术，1984年美国Cetus公司的KaryMillis所发明。•反应体系的要求引物、具有热稳定的酶、dNTP、目的DNA序列•PCR反应分三步完成：第一步——900C高温下，使混合物的DNA片断因变性而成单链。第二步——500C温度下，引物DNA结合在适于配对的DNA片断上。第三步——700C温度下，由合成酶（DNA高温聚合酶）催化，从引物开始合成目的基因DNA。•PCR的三个步骤为一次循环，约需5－10分钟。每经一次循环，所找到的目的基因扩充一倍。经过20次循环，即可扩增106倍，总共只需几个小时。PCR操作流程900C500C700C3、构造重组DNA分子•首先要用克隆载体。质粒－－环状双链小分子DNA，适于做小片断基因的载体。噬菌体DNA－－线状双链DNA，适于做大片断基因的载体。•其次要把目的基因“装”到载体中去。“安装”的过程，需要限制性内切酶。限制性内切酶造成粘性末端有利于重组DNA分子的构建用质粒构建重组DNA分子用噬菌体DNA构建重组DNA分子4、重组DNA分子导入受体细胞把构造好的重组DNA分子送进寄主细胞，亦需要适当的技术方法。若受体细胞是细菌，通常称转化；若受体细胞是动/植物细胞，通常称转染。①CaCl2处理的细菌转化法②物理学法——电穿孔法基因枪法③中间介导法——农杆菌介导④微注射法5、重组体的筛选根据载体DNA分子上的筛选标记赋予受体细胞在筛选平板上表型的变化来筛选重组子。例如由于外源DNA的插入引起抗药性失活。四、基因工程的应用基因工程技术已经在医学、工业、农业等各个领域得到了广泛的应用。1.基因工程药物将目的基因用DNA重组的方法连接在载体上，然后将载体导入靶细胞，使目的基因在靶细胞中得到表达，最后将表达的目的蛋白质提纯及做成制剂，从而成为蛋白类药或疫苗。基因工程被用于大量生产过去难以得到或几乎不可能得到的蛋白质－肽类药物。胰岛素1000磅牛胰10克胰岛素200升发酵液10克胰岛素干扰素1200升人血1升发酵液2－3万美元/病人200－300美元/病人1976年第一家基因工程技术开发药物的公司建立。1982年第一个基因工程药物重组人胰岛素正式生产，推向市场。2002年全球生物技术公司总数已达4284家，美国占34％。2004年基因重组生物技术药物的年销售额已经突破400亿美元。2005年市场上的生物技术药物达到200种左右，而在研的药物为600种。全世界已有2.5亿人使用生物技术药物和疫苗。国外生物医药的发展国内生物医药的发展——起步晚，起点低，但发展迅速1989年我国批准了第一个在我国生产的基因工程药物--重组人干扰素。近年来我国生物制药业销售收入以平均超过20%的速度增长。2.转基因植物•通过将目的基因导入农作物、园艺作物中，改变它们的遗传特性，使植物免受病虫的危害，或获得抗除草剂的特性，或改变种子种淀粉、蛋白质的含量和组成、或改变花的形状和颜色，或改变植物的育性及改变植物的抗逆性等。•转基因植物可作为一种生物反应器，生产药用蛋白和植物次生代谢产物，或生产某些有机化合物。•转基因植物为人们研究某一基因功能及其再生长发育中的作用提供了强有力的工具。根癌杆菌介导法世界上第一种基因移植作物是一种含有抗生素药类抗体的烟草，1983年得以培植出来。1994年，美国政府批准了他们研制成功抗干旱、早熟、保鲜的转基因番茄商品化之后，我国也相继成功培育出优良品种的转基因番茄，以满足人们的需求。甜椒在栽培的过程中，容易受病毒的感染。我国科学工作者，采用转基因技术，培育出抗病毒的甜椒。油菜是人们食用油的主要来源之一。一般油菜籽的含油量约为40％左右。通过转基因技术，培育出来的油菜籽，可以大大地提高它的出油率。而且油的纯度质量更好。玉米是主要粮食之一，又可以提炼油脂，也可以用作食品和工业的原料以及作饲料，浑身是宝。人们称它是含金的植物。如今培育出转基因玉米，品质更好，产量更高。我国科学工作者，用转基因技术，可以转变矮牵牛花的花色，使矮牵牛花的花色更加丰富多彩。从植物体中分离出合成赖氨酸的基因，把这基因转入小麦植株中，培育出转基因小麦。用这种转基因小麦制造出来的面粉，更适合用来烤面包，而且面粉中赖氨酸含量高，这种面包的营养价值高。转基因抗虫棉1990年，美国利用生物技术，合成苏云金芽孢杆菌（Bt）杀虫基因，导入棉花获得抗虫转基因棉花。借助基因工程技术把外源目的基因导入生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并在受体染色体上稳定整合，使之经过各种发育途径得到能把外源目的基因传给子代的个体，即转基因动物(transgenicanimal)。3.转基因动物转基因动物首先在小鼠获得成功。把大鼠生长因子转入小鼠得到巨大型的转基因小鼠。DNA微注射法通过激素疗法使小鼠超数排卵，开始时注射雌性妊娠血清，48小时后再注射人绒毛膜促进腺激素，这时小鼠便会超数排卵，一般情况下5-10个，超数排卵为35个；与雄性小鼠交配，然后杀掉小鼠，从其输卵管内取出受精卵；将经纯化的转基因样品迅速注射入受精卵中变大的雄性原核内；将25-40个注射了转基因的受精卵移植入代孕小鼠体内；受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代；从小鼠子代体内取出DNA样品，进行杂交，鉴定转基因的整合与否及位点；子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否遗传及表达。DNA显微注射法的基本程序中国科学院水生生物研究所朱作言首次用人的生长激素基因(hGH)构建了转基因鱼，制作的主要目的是提高生长速度、增加抗逆性以及为发育生物学和插入突变提供研究的材料。转基因鱼动物生物反应器乳腺生物反应器:使外源基因在哺乳动物的乳腺组织（上皮细胞）中进行特异表达我们需要的蛋白产物；血液生物反应器细胞生物反应器在山羊奶中生产ATT4.基因治疗基因治疗是将正常的外源基因导入靶细胞中以弥补靶细胞所缺失或突变的基因、或抑制异常表达的基因。人类基因治疗中，将治疗基因导入靶细胞有两种途径。一种为直接体内疗法（invivo）：即，将治疗基因直接导入体内有关组织细胞；另一种为间接体内疗法（exvivo）：即，在体外先将治疗基因导入培养的靶细胞内，再将已获得表达外源基因的遗传修饰细胞回输入病人体内，达到治疗目的。腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症是常染色体隐性遗传的致死性疾病，患者由于ADA缺乏导致脱苷腺氨酸增多，改变了甲基化能力，致使淋巴细胞受损，从而导致免疫缺陷。——重症综合性免疫缺乏症（SCID）第一个基因临床治疗的方案(1990.9.14,NIH)治疗基本步骤:ADA基因+逆转录病毒载体导入患者淋巴细胞体外扩增回输病人体内淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的5%-10%维持免疫系统功能,改善病人症状遗传缺陷病人取出病人細胞腺病毒adenovirus插入修正基因感染病人細胞注射修正基因修正基因修正基因转入到患者体内基因治疗的问题与危险性•有效的目的基因过少；•安全性:导入的基因缺乏调控手段；•有效性和稳定性：缺少高效和导向的载体系统；•目前人们多重视分子水平的研究而忽略了整体研究，对整体宏观水平缺乏了解。——1999年9月17日，美国Arizona州18岁的青年格尔辛格在宾夕法尼亚大学人类基因治疗研究所接受基因治疗4天后不幸死亡，成为基因治疗实施以来第1个直接死于这种试验的病人。•人类基因组计划–1990年正式启动。–美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一价值达30亿美元的人类基因组计划。–计划旨在为30多亿个碱基对构成的人类基因组作图、精确测序，基因鉴定和功能分析，破译人类全部遗传信息•曼哈顿计划•阿波罗计划20世纪科学史上3个里程碑5.人类基因组计划（HGP）HGP的意义•了解生命的起源与进化–认识种属之间和个体之间存在差异的起因–五种“模式生物”基因组的研究：大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇和小鼠•解码生命，认识自身–了解生命体生长发育的规律•认识疾病产生的机制，掌握生老病死规律–疾病的诊断和治疗含32亿碱基对(bp)的DNA序列编码序列约占3%，非编码序列约占97%。包括约3～4万个基因，分布于22条常染色体和X、Y性染色体。人类单倍体基因组遗传图谱（连锁图谱，linkagemap)通过家谱分析和测量不同性状一起遗传（即连锁）的频率，将基因或其它DNA顺序标定在染色体上构建连锁图单位：厘摩（cM，即每次减数分裂的重组频率为1%）；Mb水平的标记作用确定基因或DNA片断在染色体的定位各基因或DNA片断的相对距离1、遗传图谱•人类基因组研究方案及技术•2、物理图谱-路标与路轨•是通过对DNA的化学测度而绘制的，反映的是DNA序列上两点之间的实际距离。•目的：把有关基因的遗传信息及其在每条染色体上的相对位置线性而系统地排列出来。•以碱基对的数目为衡量单位，精度在100kb水平•3、序