western-blot常见问题分析

Westernblot常见问题分析辉骏生物：免费服务热线：400-699-1663Westernblot常见问题分析1：免疫组化和WesternBlot可以用同一种抗体吗？需要考虑抗体识别的是抗原的线性表位，还是构象型表位，如果识别的是构象表位，由于westernblot的蛋白质先经过SDS-PAGE分离，蛋白质的构象表位已经被破坏，所以识别构象表位的抗体不能用于Westernblot.而免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型。2：核内抗原WesternBlot内参选择什么合适？可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，在网上查查就可以选出你要的内参。辉骏生物：免费服务热线：400-699-1663Westernblot常见问题分析3：磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加，如果有条件还可以加入其他一些磷酸化酶抑制剂。4：不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？（1）转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度），因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；（2）转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；（3）用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）；（4）使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6％。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间。辉骏生物：免费服务热线：400-699-1663Westernblot常见问题分析5:在做WesternBlot时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。6：胶不平（1）玻璃板没有刷干净，制胶架子没有放平。（2）架子没有夹紧，导致漏胶，胶面不平。（3）加入APS和TEMED的量要合适，摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀。（4）温度均匀，防止由于受热不均匀导致胶聚合不均匀。辉骏生物：免费服务热线：400-699-16637：检测生物素化蛋白质时能否用脱脂奶粉封闭？不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点。8：微笑条带，比正常条带窄或宽等。（1）凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓，放置加样孔出现不平。（2）拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲。（3）样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度。（4）每个加样孔体积应一致，防止由于体积不同导致不同孔之间的挤压。（5）上样量太大及电压太高都会导致不正常条带的出现。Westernblot常见问题分析辉骏生物：免费服务热线：400-699-1663Westernblot常见问题分析9:胶片是一片空白，是怎么回事？如果能能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。(1)二抗的HRP活性太强，将底物消耗光；(2)ECL底物中H2O2，不稳定，失活；(3)ECL底物没覆盖到相应位置；(4)二抗失活。10:背景很高(1)洗膜不充分，可以增加膜洗涤次数。(2)封闭不完全，选择合适的封闭液和提高封闭时间。(3)二抗浓度过高，降低二抗浓度(4)一抗特异性不强，换用特异性较强的单克隆抗体。(5)曝光时间过长，减少曝光时间。辉骏生物：免费服务热线：400-699-1663Westernblot常见问题分析11：没有条带或条带很浅(1)抗体稀释比例太低，孵育时间不够，增加抗体浓度及增加抗体孵育时间。(2)样本中不含靶蛋白或太低，设置阳性对照或增加样本上样量。(3)一抗与二抗使用不匹配。(4)转膜不好，转膜后先用丽春红染色观看染色效果。(5)曝光时间过短，增加曝光时间。12:显影液显影1分钟,和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?(1)可能是红灯造成的,可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善.胶片本来就被曝光了(2)显影时间过长.辉骏生物：免费服务热线：400-699-1663Westernblot常见问题分析13：条带位置不对或有非特性条带。(1)二抗非特异性结果，增加一个不加一抗，其他操作不变，观察背景是否是由二抗引起的。(2)一抗特异性不好，换用特异性较好的单克隆抗体。(3)蛋白质降解，提取蛋白质时冰上操作，加入蛋白酶抑制剂，避免样品反复冻融。(4)二聚体或多聚体出现，增加蛋白质变性过程及强度。(5)抗体浓度过高，降低一抗和二抗的浓度。(6)蛋白质上样量过高，降低上样量。辉骏生物：免费服务热线：400-699-1663THANKS!辉骏生物：免费服务热线：400-699-1663