PCR常见问题分析及解决策略

PCR常见问题、原因分析及其对策PCR技术简介PCR常见问题、原因分析及其解决方案提高PCR反应特异性的策略临床PCR检测的常见问题定量PCR常见问题PCR标准反应体系•DNA模板•引物•反应缓冲液•Mg2＋浓度•dNTPs•dH2O•耐热聚合酶反应体系对PCR扩增的影响DNA模板纯度蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应完整性模板降解会导致PCR扩增无产物浓度加量过多导致非特异性扩增增加引物特异性长度适当、避免二级结构和二聚体完整性避免反复冻融浓度应适当,过高导致非特异性增加,过低则扩增产物太少反应体系对PCR扩增的影响•过高非特异性严重•过低无扩增产物•浓度适当•避免反复冻融•pH值适当•避免污染•pH值,盐离子浓度•稳定剂,增强剂反应缓冲液dNTPsdH2OMg2＋浓度如何选择最合适的DNA聚合酶PCR用耐热DNA聚合酶Taq酶pfu酶HotstartTaq酶混合酶TaqplusLongTaqTaqplatinum特异性-----基因组扩增、RT-PCR保真性-----基因筛选、测序、克隆长片段扩增-----构建基因图谱、测序等扩增效率-----复杂模板扩增（GC含量高、二级结构）PCR试剂盒-----复杂模板扩增、大规模基因检测如何选择最合适的DNA聚合酶-----根据PCR实验需求PCR常见问题之一-----无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无M12正对照原因•模板含有抑制物，含量低•Buffer对样品不合适•引物设计不当或者发生降解•反应条件：退火温度太高，延伸时间太短•纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量•更换Buffer或调整浓度•重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物•降低退火温度、延长延伸时间对策PCR常见问题之二-----非特异性扩增现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。原因对策•引物特异性差•模板或引物浓度过高•酶量过多•Mg2+浓度偏高•退火温度偏低•循环次数过多•重新设计引物或者使用巢式PCR•适当降低模板或引物浓度•适当减少酶量•降低镁离子浓度•适当提高退火温度或使用二阶段温度法•减少循环次数PCR常见问题之三-----拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态M12原因对策•模板不纯•Buffer不合适•退火温度偏低•酶量过多•dNTP、Mg2+浓度偏高•循环次数过多•纯化模板•更换Buffer•适当提高退火温度•适量用酶•适当降低dNTP和镁离子的浓度•减少循环次数PCR常见问题之四-----假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因靶序列或扩增产物的交叉污染对策•操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；•除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。•各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。提高PCR反应特异性策略•巢式PCR（Nest-PCR）•递减PCR（TouchDownPCR）•热启动PCR（HotStartPCR）•使用PCR增强剂策略之一巢式PCRPF1PR1PF2PR2巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。策略之二递减PCR递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm5℃。特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。策略之三热启动PCR热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度；现在有很多公司都有HotStartTaq酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用；热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。策略之四使用PCR增强剂甲酰胺、DMSO、甘油、甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。增强剂浓度要适当。荧光定量PCR常见问题荧光定量PCR扩增效率确认：相关系数（R2）：大于0.98标准曲线斜率：-3~-3.5PCR扩增效率（E）：0.9~1.2重复性好：STD＜0.2特异性好荧光定量PCR常见问题无Ct值（信号）出现或出现过晚：阴性对照出现明显的扩增：荧光PCRmix或水污染；出现引物二聚体：设计特异性引物。反应循环数不够；检测荧光信号步骤有误；引物、探针设计不佳或降解；模板量少或降解。反应条件或体系不佳：优化；扩增片段过长：100~200bp。荧光定量PCR常见问题溶解曲线不止一个主峰：引物设计不佳：设计特异性引物；引物浓度不适：降低引物浓度；退火温度低：调整退火温度；镁离子浓度过高：降低镁离子浓度；模板中有基因组污染：注意提取过程；耗材仪器不匹配；反应体系污染等：设置阳性阴性对照。荧光定量PCR常见问题扩增效率低：重复性不好：反应体系中部分成分尤其是荧光染料降解；反应条件不佳：延长退火、延伸时间，改为三步法，降低退火温度，提高引物浓度，重新设计引物；反应体系中有抑制物：一般为模板引入。加样不准确；仪器温度均一性不好；模板浓度低。荧光定量PCR常见问题扩增曲线不正常：基线等设置不当：减小基线终点；模板量过多：将模板稀释。临床PCR检测的常见问题假阳性问题假阴性问题定量问题方法学问题：靶基因序列特异性、引物错配、非特异性扩增污染问题：样本污染、产物污染试剂因素操作因素仪器因素标本因素外标定量与内标定量临床PCR检测常见问题解决办法严格区分及实验人员培训；使用UNG技术。假阳性解决办法：假阴性解决办法：设置阳性对照监测试剂问题；降低操作难度，提高操作人员素质；阳性对照、标准曲线或使用内对照监控仪器故障；使用抗干扰能力强的试剂提取样本DNA。临床PCR检测常见问题解决办法外标定量与内标定量：外标定量内标定量优点能做标准曲线定量，线性范围宽；成本低，易实现标准品和样本的反应完全一致，误差最小定量最准确缺点反应情况的同步性较内标定量差只能一点定标，线性范围有限；标准与样本的信号区分要不同的检测信号，难度大，成本高RT常见问题1.RNA降解或起始量少2.RNA含抑制成分3.cDNA5’端不全4.目的基因在组织中不表达或表达量太低原因对策1.分离高质量的RNA2.使用高温逆转录酶，如RT007（BioFlux）3.使用随机引物或GSP4.尝试其它组织问题1：RT-PCR没有产物PCRRT-PCR六种Taq和MasterMix：Taq、Pfu、HotStartTaq、Taqplus、LongTaq、TaqPlatinumdNTP引物SP6,Tn7,M13SuperRNaseH-ReverseTranscriptaseTA克隆系统：pBS-T载体、连接和克隆试剂盒pGM-T载体、连接和克隆试剂盒pCF-T、pCF-Blunt载体、快速连接试剂盒感受态细胞DNAMarker：22种不同大小的分子量标准TIANGEN相关产品