抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒(PNP比色法)

北京雷根生物技术有限公司抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)检测试剂盒(PNP比色法)简介：酸酸性磷酸酶(acidphosphatase，ACP)分布极广泛，遍布各种组织，主要存在于细胞的溶酶体内，所以常作为溶酶体标志酶。溶酶体外的酸性磷酸酶存在于内质网和胞质内，各种动物中的酸性磷酸酶各有不同，酸性磷酸酶适宜pH。存在于正常人肺泡巨噬细胞和白血病人脾脏的抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistntacidphosphatase，TRAP)均在细胞滤泡中，并不是释放入血液，血液中的TRAP绝大多数来源于破骨细胞，因此可以通过测量血液中的TRAP了解破骨细胞的功能状态，几乎被认为是是机体破骨活性的唯一血液指标。TRAP一种糖基化的含金属蛋白酶，在破骨细胞(osteoclast)和破软骨细胞(chondroclast)中高表达，在活化的巨噬细胞和神经元中也有表达。Leagene抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)检测试剂盒(PNP比色法)(TartrateResistntAcidPhosphataseColorimetricAssayKit)检测原理是利用Para-nitrophenylphosphate(pNPP)为一种常用的磷酸酶显色底物，在酸性条件下，可在酸性磷酸酶的作用下生成p-nitrophenol。在碱性条件下p-nitrophenol呈黄色，产物黄色越深，说明酸性磷酸酶活性越高，反之则酶活性越低，通过分光光度计测定吸光度，据此通过比色分析就可以计算出酸性磷酸酶活性水平。在适量的酒石酸存在的情况下进行酸性磷酸酶的活性检测，检测得到的酸性磷酸酶的活性就是抗酒石酸酸性磷酸酶的活性。该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的抗酒石酸酸性磷酸酯酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。组成：自备材料：1、比色杯2、水浴锅或恒温箱3、分光光度计编号名称TE004560TStorage试剂(A):ACPAssaybuffer50ml4℃试剂(B):pNPP2支-20℃避光试剂(C):TartrateSolution2ml4℃试剂(D):p-nitrophenol(10mM)0.2ml-20℃避光试剂(E):StoppingSolution80mlRT使用说明书1份北京雷根生物技术有限公司操作步骤(仅供参考)：1、配制检测工作液：①配制显色工作液：取出1支pNPP，恢复至室温后溶解于ACPAssaybuffer，混匀，冰上预冷备用。新配制的显色工作液应及时用完。②配制标准品工作液：取出p-nitrophenol(10mM)恢复至室温后，取溶解于μlACPAssaybuffer，使浓度达到一定程度。2、准备样品：①血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，尿液通常也可以直接用于测定，冻存，用于抗酒石酸酸性磷酸酶的检测。②细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要可用PBS或生理盐水进行适当匀浆，一般细胞数量在106以上，组织应在100mg以上，离心取上清，冻存，用于抗酒石酸酸性磷酸酶的检测。③植物样品：取适量的植物组织加入少量生理盐水或PBS，充分捣碎或研磨，静置，用纱布或滤纸过滤，离心，留取上清液并测量体积，冻存，用于抗酒石酸酸性磷酸酶的检测。④高活性样品：如果样品中含有较高活性的抗酒石酸酸性磷酸酶，可以使用ACPAssaybuffe、PBS或生理盐水稀释后再行检测。3、加样：按照下表设置空白对照、标准品、待测样品，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。标准品的用量分别为0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.3ml，待测样品直接加0.3ml。如果样品中的酸性磷酸酯酶活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。样品的检测最好能设置平行管。4、轻轻混匀，孵育。5、每孔加入StoppingSolution终止反应。6、酶标仪检测处吸光值，如果无法检测，亦可检测范围内吸光值，一般应数小时内检测完毕。计算：酸性磷酸酶活性单位的定义：pH4.837℃条件下，每分钟水解para-nitrophenyl空白对照管标准品管待测样品管ACPAssaybuffer0.3ml(0.3-x)ml(0.3-y)ml显色工作液0.3ml0.3ml0.3mlTartrateSolution30μl30μl30μl待测样品——yml标准品工作液—xml—北京雷根生物技术有限公司所需的酸性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位。根据酶活性定义，计算出样品中的抗酒石酸酸性磷酸酶活性。注意事项：1、待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。2、建议每次测定时都做标准曲线，以使标准更准确，另外标准品需避免反复冻融。3、如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但应考虑根据比色杯的最小检测体积，尽量采用小体积的比色杯。4、所测样本的值高于标准曲线的上限，应用ACPAssaybuffer稀释样品后重新测定。5、一支显色工作液配制后需当日使用完毕，因此请注意适当多准备一些样品一起检测。6、p-nitrophenol溶液对人体有害，反应终止液有腐蚀性，请小心操作。7、如果希望进行酶活性的绝对定量，进行酶反应时应精确计时，此时推荐采用孵育30min或更长时间，以减小操作过程中的时间误差。8、待测样品中抗酒石酸酸性磷酸酶活性较低时，可适当延长孵育时间至30min。9、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。有效期：12个月有效。相关：编号名称CC0007磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁)CS0001ACK红细胞裂解液(ACKLysisBuffer)DC0032Masson三色染色液DF0135多聚甲醛溶液(4%PFA)NR0001DEPC处理水(0.1%)PS0013RIPA裂解液(强)TE0002碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(PNP微板法)