厌氧菌及检验

厌氧性细菌及检验第一节概述厌氧性细菌(anaerobicbacteria)指一群必须在无氧条件下才能生长繁殖的细菌。一、厌氧菌的分类分为两类：一类为有芽胞厌氧菌，只有一个属，即梭菌属，共有130个种。以芽胞形式存于体外。另一类为无芽胞厌氧菌，包括40多个属，300多个菌种和亚种；多为体内正常菌群，存在于皮肤、口腔、上呼吸道、肠道和泌尿生殖道。易引起这些部位的内源性感染，而不易诊断。（二）厌氧菌感染的原因1.局部组织的氧化还原电势降低如血管损伤、烧伤、动脉硬化、肿瘤压迫、组织坏死等，可造成局部组织的缺血、缺氧，使Eｈ降低；此外，大面积外伤伴有需氧菌感染消耗了氧，为厌氧菌感染提供了条件。2.机体免疫功能下降如接受免疫抑制剂、放疗或化疗的患者；糖尿病、慢性肝、肾疾病病人及老人、婴幼儿、早产儿等，因免疫力下降易併发厌氧菌感染。二、厌氧菌感染（一）厌氧菌在正常人体的分布厌氧菌与需氧菌一起组成了人体的正常菌群。人体许多部位厌氧菌在种类和数量上远多于需氧菌，如在结肠中99%的细菌都是厌氧菌。临床厌氧菌感染中，由正常菌群的无芽胞厌氧菌的感染最为多见。常见厌氧菌在正常人体的分布主要菌属皮肤上呼吸道口腔肠道尿道阴道芽胞厌氧菌梭菌属00＋＋＋－＋－无芽胞厌氧菌革兰阳性杆菌丙酸杆菌属＋＋＋＋＝＋－＋－＋－双歧杆菌属00＋＋＋0＋－乳杆菌属00＋＋＋＋－＋＋优杆菌属＋＋＋－＋＋＋0＋－放线菌属0＋－＋＋＋00革兰阴性杆菌类杆菌属0＋＋＋＋＋＋普雷沃菌属0＋＋＋＋＋＋紫单胞菌属0＋＋＋＋＋＋梭杆菌属0＋＋＋＋＋＋＋－革兰阳性球菌消化球菌属＋＋＋＋＋＋＋－＋＋消化链球菌属＋＋＋＋＋＋＋－＋＋革兰阴性球菌韦荣菌属0＋＋＋＋－＋3.机体局部屏障破坏，使厌氧菌进入周围组织和血液引起感染。（三）厌氧菌感染的临床及细菌学指征1.局部有气体产生为重要指征之一2.发生在粘膜附近的感染3.深部外伤4.有特殊的分泌物如有恶臭，暗红血色或在紫外光下发出红色荧光。如分泌物或脓汁中有硫磺颗粒即为放线菌感染。5.某些抗生素治疗无效的感染6.细菌形态培养有特征性变化如革兰染色着色不均、形态奇特、呈明显多形性；或镜检查见细菌而需氧培养为阴性者。第二节厌氧菌的微生物学检验一、标本的采集与运送（一）标本采集标本种类：血液、关节液、心包液、腹腔液、膀胱穿刺液等体液；深部脓肿渗出液、肺部渗出液、其他组织穿刺液。厌氧菌培养最好的标本是组织标本，厌氧菌在其中更易生长。采集注意事项：避免正常菌群污染，尽量避免接触空气。有些标本如鼻咽拭子、痰液、流出的脓液、阴道分泌物、粪便等因含大量的正常菌群，故不宜作厌氧菌培养。采集方法：采取深部的组织标本：需经碘酒消毒皮肤后，用注射器插入病变部位深部，抽取数毫升后，弃去一滴于酒精棉球上。尿道膀胱穿刺不同部位标本采集法标本来源收集方法封闭性脓肿针管抽取妇女生殖道后窟窿穿刺抽取下呼吸道分泌物肺穿刺术胸腔胸腔穿刺术窦道子宫腔深部创伤用静脉注射的塑料导管穿入感染部位抽取组织无菌外科切开（二）标本的运送与处理注意尽快送检，避免干燥，避免接触空气。1.针筒运送法适宜液体标本。标本抽取后排尽空气，并将针头插入无菌橡皮塞中即可送检。2.无氧小瓶运送法常用于少量脓液标本的运送。用无菌青霉素小瓶，瓶内装入0.5ｍｌ的心脑浸液(含有0.0003%的刃天青---氧化还原指示剂）,加橡皮塞后,铝盖密封，真空泵抽出瓶中空气，充入N2，连续充抽3次，最后充以CO2，高压灭菌备用。如有氧渗入小瓶，培养基则显粉红色，应弃去。运送时挑选无色小瓶，将标本用无菌注射器注入瓶中即可。3.标本充盈法送检适宜于大量液体标本运送。将液体标本装满标本瓶，加盖密封，可驱除瓶中空气。4.组织块运送法将组织块放在密封的厌氧罐中运送。罐内放入经酸化硫酸铜浸泡过的钢丝绒，其表面即有金属铜，具强还原性，能迅速吸氧，造成厌氧罐中无氧状态。5.厌氧袋运送法6.棉拭运送法（略）应在20~30min内处理完毕，最迟不超过2h，防止标本中兼性厌氧菌过度生长，抑制厌氧菌的生长。如不能及时接种，应将标本保存于室温（因冷藏对厌氧菌有害）。二、检验程序气液相色谱临床标本肉眼观察及有无气味直接涂片染色镜检分离培养（接种非选择性及选择性培养基）增菌培养（接种液体培养基）厌氧培养确定厌氧菌每个平板挑5个以上菌落每个菌落接种两个平板经48ｈ培养需氧培养厌氧培养生长兼性厌氧菌无生长专性厌氧菌菌种保存分类鉴定药物敏感试验形态与染色菌落生化反应药敏性鉴定生长2~7d三、检验方法（一）肉眼观察应观察标本的性状，如是否为脓性、带血，有无黑色坏死组织或黑色分泌物，有无硫磺样颗粒或恶臭气味等。这些有助于厌氧菌的鉴定和培养基的选择。（二）直接镜检在接种前除血液外，各种临床标本均需直接涂片染色、镜检，以了解标本中细菌的数量、形态及染色性，便于选择合适的培养基和培养方法，还可验证培养结果的成功与失败。菌名革兰染色形态及其他特征脆弱类杆菌G－两端钝圆着色深，中间色浅不均匀，有空泡，长短不一，标本有琥珀味产黑色素普雷沃菌G－球杆菌，可见多形性，长短不一，紫外线照射发红色荧光，标本有恶臭具核酸杆菌G－菌体细长，两头尖，紫色颗粒沿菌体长轴成双排列，标本有丁酸味坏死梭杆菌G－菌体细长，高度多形性，长短不一，菌体中部膨胀呈圆球形韦荣球菌G－极小的革兰阴性球菌消化链球菌G＋球形或卵圆形，呈链状的小球菌，易染成阴性乳酸杆菌G＋细长无芽胞，有时多形性，标本有乳酸气味痤疮丙酸杆菌G＋排列呈X、Y、V或栅状，标本有丙酸气味放线菌G＋分枝呈棒状，X、Y、V或栅状排列，脓汁中的黄色颗粒呈琥珀酸气味破伤风梭菌G＋细长鼓槌状，极端芽胞，圆形产气荚膜梭菌G＋粗大杆菌，呈单或双排列，有芽胞，有荚膜艰难梭菌G＋粗长杆菌，芽胞卵圆形或长方形，位于次极端厌氧菌的初步鉴定（三）分离培养1、初代培养培养基的选择：（1）非选择培养基以牛心脑浸液及布氏肉汤为基础，补充0.5%酵母浸出液，5μg/ml氯化血红素、10μg/ml维生素K1及5%－10%的脱纤维血的强化血平板。（2）选择培养基常用的有:七叶苷胆汁平板（BBE，用于脆脆弱类杆菌）卡那万古冻溶血平板（KVLB，可抑制大多数兼性厌氧菌，使产黑色素普雷沃菌早期产生黑色素）FS培养基（梭杆菌选择培养基）VS培养基（韦荣球菌选择培养基）CCFA培养基（艰难梭菌）上述培养基使用注意：①尽量使用新鲜培养基，2~4ｈ内用完；②使用前放入无氧环境，预还原处理24~48ｈ；③也可采用预还原灭菌法制备的培养基；④液体培养基应煮沸10min，驱除溶解氧，并迅速冷却，立即接种。(2)标本接种初代培养应同时接种固体和液体两种培养基，且每份标本应同时接种3个平板，分别置有氧、无氧和含5~10%CO2环境培养。如只要求厌氧培养，只需种一个厌氧血平板，并将其分为三个区，在第一、二区交界处贴放一枚灭滴灵，如纸片周围出现抑菌圈，表明有厌氧菌存在。（3）培养方法原理是通过物理、化学或生物学等方法，创造一种无氧的环境。1）厌氧罐培养法：即利用物理或化学的方法在一个密闭的罐子里造成无氧的环境。有抽气换气法和冷触媒法。抽气换气法：将种好的培养基放于罐内，在放于经烘烤的催化剂（钯粒）盘，盖子拧紧。通过罐盖上的三通管，用真空泵抽尽罐内空气，再用反复充气与抽气3次，最后充入含80%N2、10%H2、10%CO2的混合气体。钯粒用过既失活，再次使用前需将其加热至灼红。如此反复使用：2H2+O22H2O冷触媒法：利用化学方法产生H2和CO2，产生的H2在触媒的作用下，与罐内的氧结合生成水，将氧消耗掉，造成无氧环境。使用时同时抽气换气法将钯粒和接种好的平板放于厌氧罐内，然后将配套的气体发生袋剪去一角，加入10ml水,立即放于罐内，密封厌氧罐即可。钯催化剂2)厌氧气袋法：原理与冷触媒法相同，只是用无毒的塑料薄膜制成的特殊气袋取代厌氧罐。优点：简便易行，携带方便，尤适宜于床边接种，和基层医院使用。3）厌氧手套箱：为国际公认的厌氧菌培养的最佳设备。为一个密闭的大型金属箱，由手套操作箱和传递箱两个部分组成，操作箱内还附有小型恒温培养箱，通过自动化装置自动抽气、换气，保持箱内的厌氧状态。优点：因接种、培养和鉴定等都是在无氧状态下进行，提高了检验的阳性率；缺点：设备昂贵，耗气。4)疱肉培养法：肉渣加适量液体培养基，表面盖以凡士林。肉渣含不饱和脂肪酸，可吸收氧，并含谷光甘肽，可降低培养基的氧化还原电势。适用于所有厌氧菌的培养和菌种保存(4)结果观察厌氧菌的初代培养生长较慢，故应在48ｈ后才能初步观察，如疑为放线菌则应延长至72－96ｈ。观察时应注意：①厌氧菌在对数生长期对氧非常敏感，故在培养的48ｈ不应使细菌暴露于空气中；②标本镜检阳性，但培养48ｈ却无菌生长，应继续培养5－7ｄ。2.次代培养和厌氧菌的确定初代厌氧培养有细菌生长时，需做耐氧试验，确定是否为厌氧菌。方法是：从每个平板上挑取4－5个不同性状的菌落，每个菌落分别接种3个平板（每个平板分4－6个区，可同时做4－6个菌落的次代培养）。分别放有氧、无氧和含5%－10%CO2环境中培养48ｈ，如只在厌氧环境中生长的细菌，即为厌氧菌。四、鉴定试验初步鉴定；菌体形态、染色反应、菌落性状、对某些抗生素的敏感性；最后鉴定：依据生化反应和终末代谢产物。1.形态与染色：对其鉴定较为重要。2.菌落性状：包括其形态、大小、色素、荧光及溶血等。色素：产黑色素普雷沃菌、不解糖紫单胞菌—2~10天—黑色素龋齿放线菌3~4天粉红色色素奈氏放线菌—培养时间延长—黄褐色溶血：产气荚膜芽胞梭菌血平板）—形成双溶血环荧光：产黑色素普雷沃菌、不解糖紫单胞菌某些株——在紫外线照射下—红色荧光梭杆菌—黄绿色荧光；艰难梭菌—绿色荧光3.抗生素敏感鉴定试验常用抗生素：卡那霉素、万古霉素、多黏菌素；一般抑菌环直径＜10mm为耐药。分梭杆菌属对卡那霉素（敏感）—类杆菌（多数不敏感）革兰阳性厌氧菌对万古霉素（敏感），对黏菌素耐药。4.聚茴香脑磺酸钠（SPS）敏感试验用于鉴定厌氧消化链球菌（特别敏感）。5.生化试验糖发酵、吲哚试验、硝酸盐还原试验、触媒试验等。可用自动微生物鉴定系统如：VITEK-ANT\Microscan-ANI等；胞外酶快速鉴定试验：利用厌氧菌产生的酶，与少量的生化基质反应，不需培养，只需浓菌液即可，4小时可观察结果。6.气液相色谱技术厌氧罐厌氧袋VITEK全自动微生物分析系统的基本配置MicroScan自动微生物鉴定／药敏测试系统衣氏放线菌在厌氧血平板上的光滑型菌落MicroScan自动微生物鉴定／药敏产黑素普氏菌厌氧菌的动力观察法