微生物之微生物多样性分析-DGGE

变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）普通的聚丙烯酰胺凝胶电泳只能通过片段大小不同在同一浓度的胶上电泳迁移率不同而分离不同的DNA片段，对于片段大小接近或相同的DNA片段无法做到有效地分离；DGGE(denaturinggradientgelelectrophoresis)即变性梯度凝胶电泳，是利用DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。DGGE作为一种成熟的分子生物学技术被广泛应用于环境科学（土壤、海洋、河流、冰川、淤泥等）、医学（各种疾病治疗前后，病变部位微生物的差异）、人体（鼻咽、口腔、黏膜、肠道）等领域进行微生物多样性分析。实验流程图：实验结果实验结果包括以下内容1引物设计以下是DGGE中常用的引物，我们将根据客户的不同需求，进行针对性的引物设计。引物序列（5’-3’）细菌16SV3区扩增引物357-F-GCCGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG518rATTACCGCGGCTGCTGG引物序列（5’-3’）真核18SV1-3区扩增引物Euk1ACTGGTTGATCCTGCCAGEukA516r-GCCGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACCAGACTTGCCCTCC2基因组DNA抽提电泳检测图针对客户的样本来源不同，我们针对性优化不同的基因组抽提方法，已达到提取效果最佳。说明：1-8为样本所抽提基因组DNA，上样量3uL；M为1kbMarker上数第一条带为8kb，中间的亮带为3kb，浓度为30ng/uL，其余为10ng/uL。3目的片段PCR检测说明：1-8为样本，负为负对照（说明我们的实验没有污染，这对分子实验是至关重要的），上样量为5uL；M为DL2000Marker，上样量3uL。其中亮带为20ng/uL，其余为10ng/uL。ReconditioningPCR：第一轮PCR产物将会作为新的模板再进行少数循环的第二轮PCR扩增，这叫做“ReconditioningPCR”。由于在“ReconditioningPCR”的过程中引物和模板之间的比例始终保持在较高的水平上，因此可以保证引物与模板之间的退火要优先于不同模板之间的退火，消除异源双链（Heteroduplex）污染对于PCR-DGGE图谱的观察和分析。参考文献：(1)Heteroduplexesinmixed-templateamplifications:formation,consequenceandeliminationby“reconditioningPCR”.2002.NucleicAcidsResearch.(2)不同外源扰动因素对肠道菌群组成结构影响的研究.上海交通大学2008届博士学位论文.4DGGE图谱分析4.1DGGE胶图和条形图4.2戴斯相似性系数图注：lane:代表样品编号4.3微生物多样性指数4.4UPGAM法进行样品间的聚类分析图常见聚类分析方法有NeighborJoining、singlelinkage、completelinkage、upgama、wpgama、centroid、median、ward’s4.5微生物群落的多维定标分析4.6主成分分析（PCA,PrincipalComponentAnalysis）4.7冗余分析（RDA,RedundancyAnalysis）5主要胶条进行割胶6割胶条带的DNA回收、二扩及TA克隆6.1二扩电泳检测分别取5μLPCR产物，于1%琼脂糖凝胶电泳检测。琼脂糖凝胶电泳检测结果如下图所示电泳检测结果显示：PCR产物条带单一，片段大小正确，可进行胶回收。6.2胶回收采用AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，取3μL回收产物进行电泳检测。6.3TA连接及转化PCR产物的克隆使用BioLinker的pED-T载体试剂盒。6.4阳性克隆的筛选及测序在平板上随机挑取8个克隆摇菌，菌液进行M13检测，挑取3个阳性克隆进行测序。7测序结果汇总7.1fasta文件全部测序结果进行整理，去除载体序列，将其整理为fasta格式的序列文件，为后续分析做准备。7.2克隆子一致性分析（Alignment比对）一般每个条带送三个克隆子进行测序，那么三个克隆子所测序列的一致性如何，我们通过clonemanager软件进行序列性的分析，如果克隆子的测序结果完全一致，那么会以绿色的覆盖形式表示，若是序列不一致，会是白色区域。如下图所示：7.3测序结果NCBI的Blast比对汇总表条带克隆子菌株名称GenBank序最大相似条带占比编号编号列号度（%）（%）13WinogradskyellaulvaestrainKMM6390NR_109172.191677Polaribacterirgensiistrain23-PNR_044733.1993324Cyanothecesp.ATCC51142strainATCC51142NR_074316.193335Clostridiumpopuletistrain743ANR_026103.199337CandidatusPelagibacterubiqueHTCC1062strainHTCC1062NR_074224.11003333ParaprevotellaclaraYIT11840NR_041626.1100678FlavobacteriumlimicolastrainST-82NR_024787.1973341BacteroidesvulgatusATCC8482strainATCC8482NR_074515.110010051BacteroidesfragilisYCH46strainYCH46NR_074839.19910061BacteroidesgallinarumstrainJCM13658NR_041448.19810071MegamonasrupellensisstrainFM1025NR_044473.1971007.4测序结果的系统发育树分析DGGE技术的优缺点优点：1.高效，理论上可以分离开一个碱基差异的DNA片段。2.方便，不用对样品进行标记3.快速，对于已知DGGE条件的样品，可在短时间能获取DGGE图谱4.直观，DGGE图谱可直观的反应出样品中个组分的丰富度5.稳定，DGGE作为一种成熟的技术，可重复性高6.可多样本同时分析，展现各样本的差异缺点：1.仅能检测样本中的主要微生物，占总量1%以上的微生物才能被检测到。2.DGGE只能对200-700bp的片段有效地分离，过大或者过小的片段分离效果都不是很好。3.因为仪器数值有上限，对于某些某种主要菌株占比较大又要展现大部分条带的样品，通过DGGE图谱不能很好的反映出各个菌株的丰富度。4.不同序列的DNA有可能发生共迁移而导致某些条带会有多种不同的DNA片段5.因为某些物种的基因不同拷贝之间存在异质性，即使一个碱基的差别都会使他们分开，而导致不同的条带是相同物种。6.DGGE技术对微生物的分类鉴定依赖于基因数据库,若数据库中基因序列信息不够丰富,将会限制DGGE的使用。7.由于某些种类的16SrDNA不同拷贝之间的多态性问题,可能导致自然群落中细菌数量的过多估计。送样要求1、环境样品基因组DNA1）请提供浓度大于10ng/uL，总量大于500ng的基因组DNA，DNA纯度较差或降解严重会影响后继的扩增实验。如果方便的话，可提供电子版DNA电泳检测照片及OD260/280比值。2）样品在保存期间避免反复冻融。3）送样务必标清楚样品编号，并用parafilm膜对管口进行密封。4）请务必填写完整的送样订单，并用自封袋密封后同样品一起送样，以便收到样品后妥善保存。2、环境样品1）送样样品尽量保证新鲜，为了防止微生物死亡或DNA降解，采样后建议立即冰冻保存，如样本极为珍贵，建议采用液氮速冻后-80℃冰箱保存。2）样品在保存期间避免反复冻融。3）若是样品中含有大量的腐殖质酸、重金属等PCR反应抑制剂，请在送样时注明。4）请务必填写完整的送样订单，并用自封袋密封后同样品一起送样，以便收到样品后妥善保存。送样条件：以上两种类型的样本，送样时采用干冰保存运输；若是距离较远，建议采用干冰加冰袋，存放于冰盒中。3、各类未抽提基因组样品的送样量：土壤：3-5g（干沙土、干粘土、农田土、堆肥、底泥、泥炭土、淤泥等）粪便：3-5g肠道内容物：3-5g动物组织：3-5g（鳃、胃粘膜、肠粘膜、口腔黏膜等）分泌物：2-3mL（唾液、鼻涕、汗液、泪水等）水样：2L以上水过滤后的滤膜，若环境中微生物丰富，可适当减少水的体积。植物内生菌：10-20g叶片；3-5g根系。血液：10mL。叶片：50-100g其他来源的样品请垂询。以上用PP材料的epp管或螺口管盛装即可。