石蜡切片的制作及HE染色..

石蜡切片的制作及H.E染色•实验目的•实验原理•实验用品•方法与步骤•实验结果•实验报告实验目的•掌握小鼠组织石蜡切片的制作过程•掌握HE染色的基本原理和染色方法实验原理•利用光学显微镜对生物样品进行观察，需要样品必需要一定的厚度范围内，才能保证光线的透过性。•由于生物样品多为软性材料，所以必需将其包埋在一定的固体支持物中，常用的支持物有石蜡、火棉胶等。其中石蜡切片是最常用的光镜样品制片技术。•苏木素（Hematoxylin）与伊红（Eosin）对比染色法（简称H.E.对染法）是组织切片最常用的方法。这种方法染色广泛，对组织细胞的各种成份都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存。经过HE染色细胞核被苏木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。实验用品•实验器材：恒温箱、切片机、解剖器械、载玻片、酒精灯、染色缸和烧杯等。•实验试剂：Carnoy固定液；二甲苯；各级浓度的酒精溶液；Ehrlich苏木精染液；伊红染液•实验材料：小鼠小肠或肝组织方法与步骤•石蜡切片样本的制作•HE染色石蜡切片制作过程切片前的设备试剂准备取材固定修块冲洗修切脱水透明包埋修蜡切片粘片烤片脱蜡入水染色脱水透明封片烘干后粘贴标签。1、取材:断头处死小鼠，剖开腹腔，取出一部分肝组织，生理盐水冲洗，将其修切成小块，取材要迅速且组织块尽量小（5*5*2mm）肝脏2.固定肝组织切成小块，用固定液固定24小时。固定的作用：1:防止自溶2:防止膨胀和收缩3:使组织块硬化便于制片4:保持原有状态5:防止组织块在制片过程中损坏。6:使不同组织产生不同的折光率，对染料不同的亲和力。3.脱水70%的乙醇三级，每级15分钟85%的乙醇一级，每级15分钟95%的乙醇一级，每级15分钟100%的乙醇三级，每级15分钟4.透明、透蜡•100%的乙醇（1/2）+二甲苯（1/2）5分钟•100%的乙醇（1/3）+二甲苯（2/3）5分钟•纯二甲苯两级，每级5分钟•二甲苯（2/3）+石蜡（1/3）15分钟•二甲苯（1/2）+石蜡（1/2）15分钟•二甲苯（1/3）+石蜡（2/3）15分钟•纯石蜡三级，每级20~30分钟5.石蜡包埋6.切片材料上切片机切片，用蒸馏水将切片贴于干净无油的玻片上，在酒精灯上略烤，使切片展平，将贴好的片子于室温老化3—7天后，即可用于染色。1、将单张切片，用镊子夹住蜡片的一边并提起，铺于恒温水中（光亮的一面朝下）立即用毛笔轻轻拉展以切片无皱褶为最好。2、待切片在恒温水内充分摊开展平后，将载玻片垂直插入水中轻靠切片，随即将玻片直立提起，拨正切片位置。3、用铅笔在玻片的毛玻璃上写上标本编号，字要写得小而清楚、端正。4、贴好的切片置于60℃恒温箱内干燥2小时，蛋白质凝固后即可染色。7.贴片切片到水；染色；蓝化；分化；切片再入自来水流水中使其恢复蓝色。低倍镜检查见细胞核呈蓝色、结构清楚；细胞质或结缔组织纤维成分无色为标准。然后入蒸馏水漂洗一次；切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3～5min；复染；放入95%乙醇中洗去多余的红色，入无水乙醇中3～5min；二甲苯透明，封片，镜检。染色•切片入苏木色精中染色约10～30min。染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长。室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色。蓝化•用自来水流水冲洗约15min。冲洗过程中使切片颜色发蓝。冲洗过程中使切片颜色发蓝（或入碱性水也可，但用促蓝剂对伊红可能拒染，如果时间来得及，应以流水冲洗使切片显示蓝色为宜），但要注意流水不能过大，以防切片脱落，并随时用显微镜检查见颜色变蓝为止。分化•就是将细胞质着的色褪去，使细胞核着色更加鲜明，也称分色。将切片放入1%盐酸酒精液（盐酸1份＋70％乙醇100份）中褪色，见切片变红，颜色较浅时即可，约数秒至数十秒钟。这一步骤是H.E.染色成败的关键，如分化不当会导致染色不匀、或深或浅，得到的切片染色效果差。如果染色适中，可取消此步骤。复染•用0.5%伊红酒精液（伊红0.5g＋95％乙醇100ml）对比染色2～5min。伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏木色精染细胞核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。可在伊红酒精液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色。实验结果实验报告•绘图表示H.E染色的染色结果；•在H.E染色中有哪些需要注意的步骤？