抗肿瘤药的药效

优秀精品课件文档资料2抗肿瘤新药的主要药效学和毒理学研究李波中国药品生物制品检定所国家药物安全评价监测中心3新药的开发过程$600millions6to12YearsDrugDiscoveryNon-ClinicalDevelopmentClinicalTrialsPhaseIIIPhaseIIPhaseIMarketLaunchCSFHDPDSubmissionamToxicology/ADME4抗肿瘤药物分类(1)细胞毒类药物(cytotoxicagent)：包括干扰核酸和蛋白质合成、抑制拓扑异构酶及作用于微管系统的药物等(2)生物反应调节剂(biologicalresponsemodifier)(3)肿瘤耐药逆转剂(resistancereversalagent)(4)肿瘤治疗增敏剂(oncotherapysensitizer)(5)肿瘤血管生成抑制剂(tumorangiogenesisinhibitor)(6)分化诱导剂(differentiationinducingagent)(7)生长因子抑制剂(growthfactorinhibitor)(8)反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide)5抗肿瘤药物药效学包括体外抗肿瘤试验，体内抗肿瘤试验评价药物的抗癌活性时，以体内试验结果为主，同时参考体外试验结果以做出正确的结论。I类抗肿瘤新药应进行药物作用机制初步研究。6体外抗肿瘤活性试验试验目的对候选化合物进行初步筛选了解候选化合物的抗瘤谱为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考，如剂量范围、肿瘤类别等7试验方法选用10-15株人癌细胞株根据试验目的选择相应细胞系及适量的细胞接种浓度，按常规细胞培养法进行培养推荐使用四氮唑盐MTT还原法、XTT还原法、磺酰罗丹明B(SRB)染色法、或51Cr释放试验、集落形成法等测定药物的抗癌作用。药物与细胞共培养时间一般为48-72小时，贴壁细胞需先贴壁24小时后再给药。试验应设阳性及阴性对照组，阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药，阴性对照为溶媒对照。8测定细胞生长和存活方法MTT法和XTT法是代谢测定法，没有颜色的tetrazoliumsalt(MTT和XTT)被细胞还原，产生具有颜色的与活细胞数成比例的formazan，比色测定。为了简化MTTsolubilization步骤，发展了XTTtetrazolium测定方法，MTT还原产生不溶性formazan,比色测定前溶解于DMSO，XTT试剂可被活细胞直接代谢成水溶性formazan，不需进一步处理培养细胞，便可以立即读取光密度。方便简单，其缺点是可产生相对比较高的背景数据，同时也具有MTT的不稳定终点特性。9测定细胞生长和存活方法对系列蛋白质染色剂进行实验，发现磺酰罗丹明B（sulforhodamineB）(SRB)可替代tetrazoliumassay方法，具有最好的燃料结合强度，信噪比率，并且和细胞数具有很好的线形关系，SRB是一亮粉色染料，在稀醋酸中，可结合于TCA固定细胞的碱性氨基酸上。具有十分稳定的终点。10评价标准以同一样品不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图可得到剂量效应曲线采用Logit法计算半数有效浓度(IC50值或EC50值)。体外试验至少重复一次。11体内抗肿瘤试验体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型动物肿瘤移植模型人类肿瘤裸鼠移植瘤模型重复试验鼓励使用人类肿瘤裸鼠移植瘤模型和多种类的移植瘤模型、原位接种模型和中空纤维测定(hollow-fiberassay)等方法。12动物动物要求健康，符合等级动物要求，有实验动物合格证。雌雄均可，但同一批实验中动物性别必须相同。小鼠鼠龄为5-6周，体重为18-22克。评价同一物质的活性时，不同批次的实验必须采用同一品系的小鼠。13肿瘤模型小鼠肿瘤模型淋巴细胞白血病腹水瘤L1210和P388、白血病L-615、宫颈癌U14、肝癌H22、Lewis肺癌、黑色素瘤B16、网织细胞瘤M5076、肠癌26、肠腺癌38、乳腺癌CD8F1、艾氏腹水瘤（EAC）、肉瘤-180等，以及各种小鼠肿瘤的亚型和耐药株等。14肿瘤模型人类肿瘤裸鼠移植模型应选用体外试验敏感细胞株进行体内抗人类肿瘤裸鼠移植试验。15缺点部分模型很难构建，皮下抑制肿瘤很少转移，生存时间不适合作为试验终点优点可预测细胞毒类化合物的活性有助于筛选化合物，为临床用药程序和联合用药方案提供参考可用于研究获得性药物抗性人癌移植模型16人癌移植模型NCI回顾性研究：多个人癌移植模型试验的阳性结果可在一定程度上提示临床有效性非小细胞肺癌移植模型具有临床相关性通常移植临床拟治疗的肿瘤细胞17人类肿瘤裸鼠移植模型建立时的注意点1.移植瘤一般由相应的细胞株移植而建立，对细胞株和移植瘤的化疗敏感性应予了解。2.移植瘤复苏后一般应传2-3代后再用于体内抗肿瘤试验。3.对模型生长情况应全面了解，尤其是生长快的模型4.为了保持移植瘤的生物学特性和遗传特性，复苏后移植瘤体内传代应少于15-20代18人类肿瘤裸鼠移植模型建立时的注意点细胞要求达到最低质量保证标准（支原体、MAP、人类同功酶、核型和体内致瘤性的检查）、适应同一培养液以及具有可重复的生长和药物敏感特性。制备大量的保种细胞，并冷冻保存，用于药物筛选过程中细胞经20代传代后的替换。所有细胞在筛选过程中均要进行详细特性确认，如组织病理、超微结构、免疫细胞化学，以确定和证明组织和肿瘤类型。19肿瘤模型产生免疫原性的表现近交系动物的遗传特性发生漂移，对肿瘤模型产生免疫性。产生免疫性的表现有：1.在传代和对照组中出现肿瘤消退，假如肿瘤出现溃疡、消退和再生长，可能是感染造成，如果是溃疡、消退，并且不再生长，通常是由于免疫原性引起。如果用60mg的同种肿瘤攻击动物，结果没有生长，基本可以肯定产生了免疫性。20肿瘤模型产生免疫原性的表现2.在化疗实验中有大于2个剂量水平的治愈时，应怀疑有免疫原性在起作用。3.在生命延长期实验中，存活动物的生命延长增长百分率应小于250%，如果大于250%应怀疑有免疫原性在起作用。4.缺乏明显的侵袭性和转移，可能是由于肿瘤的恶性程度比较低，也可能是由于免疫性问题造成。21肿瘤模型产生免疫原性的表现5.对药物反应性的改变表明免疫原性的形成。6.肿瘤在后期阶段比早期阶段的反应更好，肯定表明是免疫性参与，对于均质性的肿瘤模型而言，开始给药的时间越早，肿瘤反应越好，免疫反应要经对抗原的识别和处理后才能产生。给予小鼠两次用X-射线杀死的肿瘤细胞，间隔10天，再10天后，给处理和没有处理的小鼠移植活的肿瘤细胞，检测免疫性的产生是一种很好方法，费时、费力。22试验过程肿瘤接种方法皮下接种腹腔接种原位接种23皮下肿瘤模型选择肿瘤生长旺盛且无溃破的荷瘤小鼠，颈椎脱臼处死，在无菌条件下（超净台或接种罩），用碘酒、酒精或新洁尔灭消毒动物皮肤，切开皮肤，剥离肿瘤。将瘤组织剪成1.5mm3左右，用套管针接种于动物一侧或双侧腋窝皮下；或制成细胞悬液，然后按一定比例加入无菌生理盐水，一般每只小鼠接种肿瘤细胞数量为（1-5）×106。24腹水瘤模型无菌条件下，消毒动物皮肤，吸取生长良好的动物腹水，以生理盐水按一定比例稀释后接种于动物腹腔，接种细胞数量一般为（1-5）×106。25原位接种模型原位接种是指将来源于某脏器的肿瘤接种在动物的某脏器，如将人肝癌接种在裸小鼠的肝脏。原位接种不是常规的方法，但有其优越性，是鼓励使用的方法。主要有肺、肝、胃、肠、乳腺、颅内等原位接种方法26实验设计试验设阴性对照组、阳性对照组、治疗组。治疗组设高、中、低三个剂量组。小鼠肿瘤和腹水瘤接种后次日将动物随机分组，裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100—300mm3后将动物随机分组。动物数普通小鼠每组10只，裸鼠6只。27剂量设置治疗组设高、中、低剂量治疗组，一般按4:2:1设置，高剂量使用最大耐受量或LD10的剂量。阴性对照组给予相应的溶剂；阳性对照药选用对该动物敏感的、临床应用的抗肿瘤药物，如受试物为一抗癌药物的衍生物或类似物时，必须选用该抗癌药物作为阳性对照药。28阳性对照药选择原则疗效确切与被试物质化学结构类似与被试物质有类似的作用机理。29药物配制溶于水的药物，用生理盐水或蒸馏水配制；如用酸、碱溶解者，可先用小量酸(0.1-0.5NHCl)或碱(NaHCO3、Na2CO3、NaOH)溶解，调节pH在4.5-9.0的范围内。用乙醇、丙二醇、吐温80、DMSO助溶的药物，或用吐温60、吐温80、2-3%淀粉、0.5%羧甲基纤维素制成混悬液的药物，可腹腔注射或口服，但必须设相同浓度的溶剂对照组。用注射用花生油配制的溶液或乳剂可口服、皮下或肌肉注射。30给药方案和给药途径分组当日开始给药，根据不同药物的代谢动力学和毒性反应等确定给药方案。给药途径应与推荐临床用药的途径相同。给药次数较多，或被试物质溶解性较差，静脉给药有困难时，可考虑使用腹腔给药，但在评价药效时要注意这两种给药途径是有差别的。可采取瘤周、瘤内、肌肉、皮下给药途径。腹水瘤试验时一般不能应用腹腔给药途径。31评价标准腹水瘤模型接种给药后，观察和记录动物死亡时间，计算生存天数。如阴性对照组20%动物存活时间超过4周，表明腹水瘤生长不良，实验作废。32评价标准裸鼠移植瘤模型推荐使用测量瘤径的方法，动态观察受试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数根据移植瘤的生长情况而定，一般为每周2-3次,每次测量同时还需称鼠重。33评价标准肿瘤体积(tumorvolume,TV)的计算公式为：V=1/2×a×b2或π/6×a×b×c其中a、b、c分别表示长宽高。两公式的相关性极好，可采用任一公式。根据测量结果计算出相对肿瘤体积（relativetumorvolume，RTV），RTV=Vt/V0。其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。34评价标准抗肿瘤活性评价指标为相对肿瘤增殖率T/C（%）TRTVT/C%=────×100%CRTVTRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV。疗效评价标准：T/C%60%为无效；T/C%≤60（42？）%，并经统计学处理P0.05为有效。35评价标准（小鼠肿瘤模型）生长较慢小鼠肿瘤采用与裸鼠移植瘤同样的测量瘤径的评价方法。生长较快小鼠肿瘤可采用称瘤重的方法评价。试验结束后处死动物，称体重，解剖剥离瘤块，称瘤重。阴性对照组肿瘤平均瘤重小于1克，或20%肿瘤重量小于400毫克，表示肿瘤生长不良，试验作废。36评价标准（小鼠肿瘤模型）疗效评价公式：给药组平均瘤重-阴性对照组平均瘤重肿瘤生长抑制率=─────────────────×100%阴性对照组平均瘤重评价标准肿瘤生长抑制率40%为无效；肿瘤生长抑制率≥40%，并经统计学处理P0.05为有效37评价标准（原位接种模型）不同原位接种模型可采用不同评价方法，主要有瘤重和生存时间评价法。如肝原位接种可用瘤重评价，颅内接种可用生存时间评价。评价方法、标准和注意事项同腹水瘤模型和小鼠肿瘤模型。38抗肿瘤药物的特殊要求I类抗肿瘤新药应进行药物作用机制的初步研究。非细胞毒类药物除完成体内外抗肿瘤试验，还应进行特定抗肿瘤作用研究。39生物反应调节剂药效学包括：体内抗癌试验和免疫功能研究。体内抗癌试验注意点：模型：裸鼠是免疫缺陷动物，一般应用正常免疫鼠肿瘤模型。给药时间：可按常规给药，也可在接种前预先给药，接种后继续给药或停药。肿瘤细胞接种量：可比细胞毒类药物低一个数量级，一般为(1-5)105个瘤细胞/小鼠。给药方法：可单独给药，也可与其它抗肿瘤药物合并使用，观察增效或减毒作用。40生物反应调节剂免疫功能试验方法具有抑瘤作用的生物反应调节剂，还需作免疫功能测定,以明确其抑瘤作用是否与免疫功能调控有关。免疫功能测定包括细胞免疫和体液免疫两方面。41生物反应调节