标-记-免-疫-技-术

标记免疫技术邹全明第三军医大学医学检验系临床微生物学和免疫学教研室标记免疫技术=抗原抗体反应示踪物标记灵敏性特异性标记免疫技术的主要特点：高特异性、高灵敏性免疫技术+标记技术标记免疫技术免疫测定技术免疫组化技术示踪物及标记技术酶免疫技术荧光免疫技术放射免疫技术化学发光技术金免疫技术生物素-亲和素免疫放大技术……第一节酶免疫技术基本原理利用酶催化底物反应的生物放大作用,提高特异性抗原-抗体免疫学反应的检测敏感性的一种标记免疫技术。基本特点：①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性。②酶促反应专一性，保证特异性。③底物反应放大作用，提高敏感性。④酶标试剂保存稳定。⑤操作简便，安全易行。一、酶免疫技术的分类酶免疫组化用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原和抗体酶免疫技术均相酶免疫测定酶免疫测定固相酶免疫测定异相酶免疫测定（ELISA）液相酶免疫测定二、酶免疫技术的技术要点（一）固相载体•基本要求结合容量高，结合稳定；可与抗原抗体复合物等大分子蛋白结合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法简便易行、快捷经济。•种类与选择1.塑料制品2.微颗粒3.膜载体（二）酶与酶作用底物1.用于标记酶的要求：•酶活性高•标记后酶活性稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性•酶催化底物后信号易判定或测定•酶活性不受样品中其他成分的影响•酶、辅助因子及底物理化性质稳定，安全无害，价廉2.常用酶及其底物（1）辣根过氧化物酶（HRP）常用底物：•邻苯二胺（OPD）：反应显橙黄色，应避光，致癌性。•四甲基联苯胺（TMB）：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性，但水溶性差。（2）碱性磷酸酶（AP）常用底物为对硝基苯磷酸酯（p-NPP），产物为黄色。*AP灵敏性高与HRP，但不易获得纯品，稳定性及酶标记物收率低于HRP，且价高，故应用不如HRP普及。（三）酶标记抗体或抗原•基本要求：酶标记抗原纯度要高，抗原性完整；抗体的特异性好，效价高，亲和力强，比活性高以及易于批量生产和分离纯化。•酶标记方法1.交联法以双功能交联剂为“桥”，分别与酶和抗体（抗原）连接形成结合物。如戊二醛交联法。2.直接法用过碘酸钠活化酶蛋白分子后，再与抗体（抗原）结合。仅适用于含糖蛋白分子的酶（如HRP）标记物制备。（四）标记抗体鉴定（五）免疫吸附剂（六）试剂最佳工作浓度的选择三、酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)(一)基本原理：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性（固相抗原／抗体的形成）在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应（抗原抗体反应）用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。（酶标抗原抗体复合物的分离）加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。（显色反应）（二）ELISA技术类型：ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶作用的底物。酶联试剂阳性对照酶标记物显色液A终止液反应板显色液B浓缩洗涤液加样枪与吸头阴性对照1．双抗体夹心法特点：非竞争结合反应常用于抗原的检测适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇2．间接法3.竞争法特点：用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行测定。酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag（Ab）具有相同的与固相Ab(Ag)结合的能力。反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab）是固定限量的，且前者的结合位点少于酶标记与非标记Ag（Ab）的分子数量和。反应后，结合与固相载体上复合物中被测定的酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非标记Ag（Ab）的浓度成反比。4.捕获法（反向间接法）•主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定。注意事项：加样应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。保温1、一般均采用水浴箱，使温度迅速平衡。2、为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔。洗涤：决定着实验的成败。目的：洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种。比色比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。用特定的波长测读吸光值。比色结果的表达以往通用光密度（opticaldensity，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法为A492nm或OD492nm。四、均相酶免疫吸测定基本原理：利用酶标抗体结合抗原形成复合物后，标记酶的活性发生改变的原理，在不将复合物与游离酶标抗体分离的情况下，直接测定系统中总的标记酶活性的改变，进而推算出待检样品中的抗原量。主要用于小分子抗原或半抗原的检测.(一)酶扩大免疫测定技术:（enzyme-multipliedimmunoassaytechnique，EMIT）•基本原理:半抗原与酶结合成酶标半抗原，保留半抗原和酶的活性。当酶标半抗原与抗体结合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性中心受影响而活性被抑制。（二）克隆酶供体免疫测定（clonedenzymedonorimmunoassay,CEDIA）利用重组DNA技术制备β-半乳糖苷酶的两个片段：大片段称为酶受体（enzymeacceptor,EA），小片段称为酶供体（enzymedonor,ED），两个片段本身均不具酶活性，但结合在一起就具有酶活性，利用这一特性建立的均相酶免疫测定称为克隆酶供体免疫测定(CEDIA)。CEDIA的反应模式为竞争法。•基本原理：标本中的抗原和ED标记的抗原与特异性抗体竞争结合，形成两种抗原抗体复合物。ED标记的抗原与抗体结合后由于空间位阻，不能再与EA结合。反应平衡后，剩余的ED标记抗原与EA结合，形成具有活性的酶，加入底物测定酶活力，酶活力的大小与标本中抗原含量呈正比。五、固相膜免疫测定•固相膜免疫测定与ELISA相类似,其特点是以微孔膜作为固相.标记物可用酶和各种有色微粒子,如彩色乳胶、胶体金等。常用固相膜为硝酸纤维素（NC）膜。类型：免疫渗滤试验：穿流形式免疫层析试验：横流形式斑点酶免疫吸附试验（dot-ELISA）免疫印迹法(Westernblot)（一）斑点ELISA(dot-ELISA)（二）免疫印迹法（immunoblottingtest，IBT）亦被称为Westernblot分三个阶段进行:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电转移酶免疫定位免疫印迹法原理示意图第二节荧光免疫技术•免疫荧光技术(immunofluorescencetechnique)是标记免疫技术中发展最早的一种。是将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和直观性结合起来的一种方法。基本原理利用荧光素标记抗体，使之在涂片上或组织切片上与标本中的待检抗原特异结合，采用高发光效率的点光源，透过滤色板发出一定波长的光，使结合在标本上的荧光素被激发而产生荧光，借助荧光显微镜观察底物片上荧光染色形态，来判断有无待检抗原或抗体。一、免疫荧光显微技术（一）基本原理：使荧光抗体与标本切片中组织或细胞表面的抗原进行反应，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明亮的特异荧光。（二）荧光抗体的制备（1）荧光抗体的标记作为标记的荧光素应符合以下要求：①应具有能与蛋白质分子形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。②荧光效率高,与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率。③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质，与蛋白质的结合物稳定，易于保存。⑤标记方法简单、安全无毒。•荧光抗体是将荧光素（如FITC）与特异性抗体以化学方式共价结合而成。常用于标记的荧光素：异硫氰酸荧光黄（FITC）四乙基罗丹明（RB200）四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）标记方法：搅拌法(适合大样品)透析法(适合小样品)标记抗体的纯化：透析法、层析分离法（2）荧光抗体的鉴定F/P比率：将制备的荧光抗体稀释至A280≈1.0，分别测读A280（蛋白质特异吸收峰）和标记荧光素的特异吸收峰。F/P值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，反之则越少。一般用于固定标本的荧光抗体以F/P＝1.5为宜，用于活细胞染色的以F/P＝2.4为宜。抗体效价：效价越大标记抗体的特异性越高非特异荧光越少。效价在1:16-1:32者较为理想。抗体特异性：免疫电泳和交叉免疫电泳观察特异性沉淀线或沉淀峰，在紫外线照射下发出强烈荧光。（三）技术类型•直接法优点：操作简便、特异性高、非特异荧光染色因素少。缺点：灵敏度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特异荧光抗体。•间接法优点：灵敏度高，在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体。既可检测抗原，也可检测抗体。（四）荧光免疫显微技术在医学检验中的应用1．血清中自身抗体的检测2．各种微生物阶快速检查和鉴定3．寄生虫感染的诊断4．白细胞分化抗原的检测5．人类白细胞抗原(HLA)的检测6．肿瘤组织中肿瘤抗原的检测7．组织中免疫球蛋白和补体组分的检测8．激素和酶的组织定位二、荧光免疫测定技术•荧光免疫测定同酶免疫测定一样，根据抗原抗体结合后是否需要将结合状态与游离状态的的荧光标记抗原（或抗体）分离开，而将之为均相和非均相两种类型。(一)时间分辨荧光免疫测定1.基本原理•时间分辨荧光免疫测定(time-resolvedfluorescenceimmunoassay，TR-FIA)是荧光分析（FIA）的基础上，用具较长寿命荧光的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）的作为标记物来标记抗体或抗原，从而检测标本中的相应抗原或抗体的新技术。2.技术类型(1)固相双位点夹心法(2)固相抗原竞争法(3)固相抗体竞争法(二)荧光偏振免疫测定FPIA是一种均相竞争荧光免疫分析法。其原理是：标本中的抗原与荧光标记的抗原竞争结合抗体。反应平衡后，与抗体结合的荧光标记抗原的量与标本中抗原浓度的量呈反比。由于抗体的分子量远大于抗原的分子量，游离的荧光标记抗原与结合抗体的荧光标记抗原所产生的偏振荧光强度相差甚远。因此在FPIA中测定的偏振荧光强度与标本中抗原的浓度呈反比。通过小分子抗原标准品与荧光偏振强度关系建立标准曲线，可检测小分子抗原的浓度。第三节放射免疫技术放射免疫分析（radioimmunoassay,RIA）免疫放射分析（immunoradiometricassay,IRMA）广义放射免疫技术还包括放射受体分析（使用受体测量抗原）和放射配体结合分析（使用配体研究受体）。特点:灵敏度高(10-9-10-15g/L)、特异性强、重复性好等一、放射免疫分析（RIA）基本原理采用定量的标记抗原（Ag＋）和非标记抗原（Ag）竞争性结合有限量特异性抗体（Ab）的反应。二、免疫放射分析（IRMA）基本原理单位点IRMA：利用过量标记抗体与待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合物，反应平衡后，用固相抗原结合反应液中剩余的未结合标记抗体并将其分离，测定上清液的放射量。双位点IRMA先用固相抗体与抗原反应结合,然后再用过量的标记抗体与已结合于固相抗原的另一抗原决定簇结合,形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物,洗弃反应液中剩余的标记抗体,测定固相上的放射性。IRMA与RIA的异同点1.标记物2．反应速率3．反应原理4．特异性5．灵敏度和检测范围6．分析误差第四节发光免疫技术•发光免疫技术(luminescence