液相色谱操作

液相色谱根据目前市场情况主要分进口和国产两大类，进口主要有美国产Waters（实验室存有Waters1525价格：35.6W）、安捷伦（实验室存有Aglient1200价格34.5W）、塞尔泰、戴安、日本岛津等系列；国产有大连依利特、大连江申、上海上分、上海伍丰、浙江温岭、北京温分等系列。液相色谱仪结构主要由贮液器、高压输液泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。1．贮液器：使用四元泵时（Aglient1200），A、B、C、D四相中，若所用流动相中有含盐流动相，则A、D（进液口位于混合器下方）放置含盐流动相，B、C（进液口位于混合器上方）放置不含盐流动相；A、B、C、D四个储液器中其中一个为棕色瓶，用于存放水相流动相。在最后通常还有一个废液瓶。使用二元泵时（Waters1525），B相位于下方，通常放置盐溶液，A相位于上方，放置有机溶剂，可使用普通玻璃溶剂瓶贮存流动相。附流动相使用注意事项：1）流动相的纯度要求：有机溶剂必须是色谱纯，水必须是超纯水且现从纯水机中取出不能过夜，缓冲溶液需现取超纯水配置，并经过0.45um滤膜（注意水相膜与油相膜不能混用）过滤除去其中的颗粒杂质和其它物质。任何流动相使用前都要经超声脱气，脱气后恢复到室温才使用。流动相使用不当引起的问题：流动相不纯会增加检测器噪声从而影响检测结果，长期积累会堵塞柱子；脱气不彻底有气泡会导致压力不稳，重现性差。2）流动相与固定相不能相互作用，否则造成柱效降低甚至损坏色谱柱。3）样品必须溶于流动相，否则会堵塞柱子。4）使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。2．高压输液泵流动相由高压泵输送和控制流量。泵由入口单向阀、出口单向阀、柱塞杆、密封圈等组成，是液相色谱仪的重要组成部分，是导致HPLC的高压、高速、高效特点的主要部件。1）使用前先进行排气purge。Waters1525：先用针筒从上下两个泵口的排液阀分别各抽取约5mL流动相，再打开参比阀（向右搬），点击purge图标，冲洗泵5min（一般是默认5min，之后仪器自己停泵），待停泵后，压力和流速都降至0后，才能关上参比阀（向左搬紧）。Aglient1200：逆时针松开参比阀，通过软件设置流速，从0上升至5mL/min，保持至少10min。2）若使用缓冲液，工作结束后需用超纯水清洗泵中残留的缓冲液。3）不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中。3．进样器：通常采用高压六通阀进样装置。手动进样：1）进样图标出现2）进样阀“Load”装样3）针先排汽泡。4）进样5）搬injected计时约10s，否则会倒流6）图标消失，拔针7）洗针（用溶剂洗）4．色谱柱使用注意事项：1）柱子使用pH范围。C18反相柱一般适用的样品pH范围在2~8，故一定要精确调节好缓冲液的pH值和样品的pH值，并注意缓冲液的浓度不得超过0.02mol/L。2）柱子使用压力范围。正常状况下流速会逐步上升，柱压也随之逐步上升直至维持较稳定的范围，最高压力不超过4000Psi，注意结合每根柱子的使用说明，每天都要记录柱压。3）柱子使用流速范围。根据不同色谱柱设定相应的流速。4）柱子方向不能接反（否则会冲坏固定相）。5）使用缓冲液时，做完样品后应立即用超纯水冲洗管路及柱子1小时，然后用甲醇冲洗40分钟以上，以确保整个管路及柱子保存于有机溶剂中。6）长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相（如甲醇等），因为纯水易长霉。5．柱温箱:控制温度，Waters1525一般设置柱温30~40℃，高于室温5℃，但必须打开示差检测器；Aglient1200可设低于室温10℃，最高可设定80℃。6．检测器：UV检测器是HPLC中应用最广泛的检测器，当检测波长范围包括可见光时，又称为紫外-可见检测器。它灵敏度高，噪音低，线性范围宽，对流速和温度均不敏感，但是梯度洗脱时，还会产生漂移。紫外检测器一般针对有紫外吸收的样品的检测，其波长设置在样品的最大吸收波长处。开机操作附1：Waters-1525液相色谱仪操作详细规程1、使用人提前一周于精密仪器室进行预约2、登记仪器使用记录，擦拭桌面灰尘，检查废液瓶（有残留的话，及时先倒至卫生间）。3、打开柱温箱检查是否为所要使用的柱子（换柱子要注意流动方向），然后依次打开柱温箱、1525泵，2487紫外检测器和2414示差检测器，等待8min，以便进行内部校正和诊断测试，检测器需要预热20min。注意纯水机的蒸馏水每天更新一次。4、准备好自己所需的流动相，并用超声波清洗器脱气30min。5、换上已脱气流动相，启动电脑，连接Breeze软件，左下角蓝色进度条完成即表示联机成功。先用针筒从上下两个泵口的排液阀分别各抽取约5mL流动相，再打开参比阀（向右搬），点击purge图标，冲洗泵5min（一般是默认5min，之后仪器自己停泵），待停泵后，压力和流速都降至0后，才能关上参比阀（向左搬紧）。6、点击ManageBreeze，选择或新建一个Project/User7、若方法之前在相应的Project/User已保存，则可直接调用出来平衡。8、新建色谱方法：点击ViewMethod，点击Pump图标，输入柱子最高限压，选择泵的模式（恒流或者梯度洗脱）、设定流速，流动相比例等；点击UVDet图标，在Channel1中输入检测波长（若检测双波长则在Channel2中输入另一波长值）；点击RIDet图标，在Temprtature中的ExternalHeater1中输入所需要的柱温箱温度，并打勾。9、平衡时，注意进样阀应处于Inject状态，点击平衡图标，选择色谱方法，系统平衡约30~60min，平衡时需注意柱压力，如有异常需及时停泵，查找原因。（柚皮苷和柚皮素的检测（280nm）平衡至少需要20min以上，待两个紫外数值差值至少有5个零方可进样）10、平衡完成后，将进样阀搬回Load状态，点击Inject图标，更改样品名称、色谱方法和跑样时间，回车，放入进样针，等出现提示进样的对话框后再进样，进样量应是定量环体积的4倍（定量环20μL，进样量80μL），每次进样时宜保持相同的打针速度，切记不能将气泡打入，进样完成后，迅速将进样阀搬至inject状态，对话框消失后，再拔针，进样针立刻用溶剂清洗至少5次（样品溶剂如果是水相，用纯水清洗，有机相则用甲醇清洗），进样前如样品量够得话，建议再用样品润洗进样针。11、样品检测结束后，按停泵图标停泵，在紫外检测器面板上按shift+1关闭紫外检测器的氘灯（延长灯的寿命），然后开始洗柱子，C18反相柱用超纯水：甲醇（95：5已脱气）冲洗40min（流速从0.5mL/min慢慢加至1.0mL/min，增加流速过程需注意压力变化，不能超过限压，Symmetry型号的最好不能超过3000PSI）。在此过程需另外超声一瓶色谱纯的甲醇。下一步清洗将超纯水换成甲醇（已脱气），然后用甲醇：甲醇（50：50）冲洗40min（流速调节同第一步的清洗过程）。12、柱子洗好后，停泵，待压力降至0后，打开参比阀，先用超纯水再用甲醇清洗进样口、进样针、泵孔，切记不能将空气打入进样口（至少5个注射器体积）。13、先关闭Breeze软件和电脑，再关柱温箱、泵、检测器，不必关闭UPS（断电保护器）。14、关机完成后，将仪器盖好防尘罩，整理实验台面，倒废液（两个都要倒干净，倒卫生间），关空调，关好门窗，并对仪器使用情况和仪器状态如实进行登记。注意事项：1.如遇停电，UPS能维持半小时，应立刻停止测样，停泵，再换超纯水：甲醇（95：5已脱气）洗柱子30min。2.正常状况下流速会逐步上升，柱压也随之逐步上升直至维持较稳定的范围，最高压力不超过4000Psi，注意结合每根柱子的使用说明，每天都要记录柱压。3.更换柱子时应先让柱前的管路通过流动相5min左右，然后再接上柱子，注意柱子的方向，并时刻观察压力。4.C18反相柱一般适用的样品pH范围在2~8，故一定要精确调节好缓冲液的pH值和样品的pH值，并注意缓冲液的浓度不得超过0.02mol/L。5.柱温箱一般设置在30~40℃，高于室温5℃，使用柱温箱一定要打开示差检测器。6.使用示差检测器，每更换一个条件就必须先purge示差检测器参比池10h，流动相要混合在一个瓶子脱气。7.从反相柱换至正相柱的步骤：甲醇异丙醇（0.2mL/min冲洗10h）正己烷（1.0mL/min冲洗4h）。8.不能对色谱方法，通道，数据等做删除处理。9.防止流动相流完，过滤头一定要浸没在流动相中。10.实验结束后确定整个仪器、色谱柱都保存在有机相中。11.缓冲液或超纯水必须每天更换新的，使用缓冲液要先用超纯水：甲醇（95：5已脱气）过渡20min。缓冲液要过0.45μm的滤膜。12.一般情况下，Breeze软件操作界面出现3个选项按NO，2个选项按YES，保存图谱时除外。13.样品要事先处理好，保证样品澄清，需要过膜的，都必须严格用0.45μm滤膜过滤（注意区别水相用膜和有机相用膜）；保证样品pH落在使用柱的pH范围内。使用Eppendorf高速离心机时候，要注意对称平衡放好，离心管如有破裂应及时将离心机通道内残留的液体吸干。14.实验室严禁烟火，仪器由专人管理，使用仪器者必须进行操作培训和考核，并获负责人批准后，方可上机进行操作。15.仪器需防震动、防灰尘，废液倒卫生间，实验中人不能离开。附2：Agilent液相色谱仪操作规程★样品与流动相要求：1.样品临用前用0.45um滤膜过滤（区别水相膜与有机相膜），或者临用前离心取上清液（转速1万，20分钟)2.缓冲溶液必须当天配制，每次使用前用0.45um的水相膜过滤，水要求使用当天的超纯水，甲醇或乙腈等有机溶剂要求使用色谱纯。流动相临用前超声脱气20分钟★液相开机操作过程：1．首先要启动电脑，进入Windows后,电脑在后台自动运行AgilentbootpService。2．从上往下打开液相色谱仪各模块前左下方的电源开关，液相各模块进入自检，右上角的指示灯不同颜色闪烁几下，最后变成橘黄色(或灭掉ALS、RID)，启动完成。3.双击电脑桌面的Instrument1联机图标，进入LC化学工作站（方法与运行控制界面）。4.调用或者编辑相应的操作方法。★液相关机操作过程：1.根据具体情况，使用水或溶剂，泵流量设为1.0ml/min,把系统的管道及柱子清洗干净。2.根据具体情况，不定时把A、B、C、D通道用有机溶剂冲洗干净，防止生长藻类等。3.把系统关闭(即把泵停下来及检测器的灯灭掉等)，若有sealwash,把其清洗的水卡住。4.先退出LC化学工作站，从下往上关掉液相色谱仪各模块前左下方的电源开关。5.退出电脑Windows系统，关掉电脑电源。★液相的数据采集操作过程：1．从化学工作站菜单的方法中编辑完整方法，或者调用方法,一般是方法存在如D:\CHEM32\1\METHODS\___.M，即运行此方法。2．从化学工作站菜单的仪器的启动系统,可点击桌面上的启动按纽，也可以点每一模块图标中的控制来开或关。(若有手动SealWash应先把打开，约每分钟20滴)3.手动进样或自动进样器单针进样时：从运行控制中的样品信息输入样品信息4.待工作站提示就绪(变绿色)、仪器基线平衡稳定后:手动进样:若是VWD或DAD先按一下平衡,把基线调零，阀在Load的状态，用注射针取样品从手动进样阀口注入，把手动阀转向Inject的方向，开始做样采集数据。★注意事项：1．C18反相柱一般适用于缓冲溶液PH值在2.2~7.8范围，超出范围柱子会损坏2．柱温箱设置可低于室温10℃，最高80℃3．四元泵的比例阀有A、B、C、D四个通道，建议将盐溶液接在下面的通道（A或D），将有机溶剂接在上面的通道（B或C）上，进样量应是定量环体积的4倍（定量环20ｕＬ，进样量80ｕＬ）4．检测结束后，C18反相柱用甲醇（脱气）冲洗柱子30分钟，若流动相是缓冲溶液时，还需先用纯水（脱气）冲洗系统60分钟，再用甲醇冲洗柱子30分钟，先用纯水再用甲醇清洗进样口5．仪器由专人管理，需要在本仪器