6、沙门氏菌检验

食源性致病菌沙门氏菌检测•食品卫生指标菌反映食品在生产、储存、运输、销售过程中细菌性污染的状况，及是否符合卫生要求的细菌检测项目。•食源性致病菌通过摄食进入人体，造成人体健康危害的细菌。指标菌：菌落总数，大肠菌群，金黄色葡萄球菌,霉菌等•食品清洁状态的标志•货架期评估，预测食品的耐保藏性•通常是定量检测，以数值大小来判断食品合格与否致病菌：沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，单增李斯特菌、溶血性链球菌、弧菌等•直接反映食品的安全性，有否造成食物中毒的潜在危害和风险•通常是定性检测，以阴性或阳性来判断食品合格与否。•根据食品的不同生产及消费方式，其卫生标准对细菌指标有不同的要求，如原料类食品一般不检测卫生指标菌，而直接入口食品（RTE）则要求同时检测卫生指标菌和致病菌。致病菌的食品卫生学意义•食品卫生标准规定任何食品中不得检出致病菌•致病菌对人体健康的威胁是直接的和肯定的•根据不同食品被污染的特点重点检验某些细菌,如蛋禽肉主检沙门氏菌，罐头检肉毒梭菌等•微生物毒素，如金葡的肠毒素、黄曲霉毒素等细菌性食物中毒•概念：由于食入被病原菌或其毒素污染的食物后所引起的以急性肠胃炎为主的疾病。•分类：感染型、毒素型、不定型病原菌常见食品潜伏期病程症状沙门氏菌肉乳蛋6~8h3~7d恶心呕吐腹痛发热冷汗头痛副溶血性弧菌水产品腌制品30~60min1~3d恶心呕吐腹痛腹泻蜡样芽孢杆菌米饭肉乳淀粉类2~24h1d恶心呕吐腹痛腹泻沙门氏菌食物中毒•引起食物中毒最常见的沙门氏菌：鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌•易引起沙门氏菌中毒的食品：肉、蛋、乳类食品,低水活度食品。•中毒原因：•1、食用病畜禽的肉制品食品•2、病畜禽、带菌人和动物使食品受污染沙门氏菌的从属与分类•肠杆菌科沙门氏菌属•下设6个亚属：I、II、IV、V、VI及III（原亚利桑那菌属）•常见的种：鸡沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌…•形态与染色：革兰氏染色阴性，无荚膜，无芽胞，多数有鞭毛，有动力，短小杆菌。•培养特性：需氧或兼性厌氧，最适温度37℃，PH7.2~7.4。•营养要求：不高，普通培养基生长良好。沙门氏菌的致病作用•人类沙门氏菌感染的临床类型：•（1）伤寒型：由伤寒、副伤寒沙门氏菌引起；•（2）败血症型：常由猪霍乱、鼠伤寒和肠炎沙门氏菌等引起；•携带者可能连续数周到数月散发病原体（eg.伤寒玛丽）沙门氏菌相关检验方法标准•GB4789.4-2016食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验参考采用了AOAC/FDA的方法。•整合了SN0170—1992《出口食品沙门氏菌属(包括亚利桑那菌)检验方法》和SN/T2552.5—2010《乳及乳制品卫生微生物学检验方法第5部分:沙门氏菌检验》•修改了10版检测流程和血清学检测操作程序、附录。非如上述的各种反应检样前增菌选择性增菌BSXLD(或HE，显色培养基)挑取可疑菌落选择性平板筛选生物化学筛选非沙门氏菌H2S+靛基质-尿素-KCN-赖氨酸+H2S+靛基质+尿素-KCN-赖氨酸+H2S-靛基质-尿素-KCN-赖氨酸+/-甘露醇+、山梨醇+ONPG-多价血清学试验报告生化鉴定试剂盒或全自动生化鉴定系统前增菌法25g+BP225mlBPW1ml+TTB10ml42℃±1℃，18h~24h1ml+SC10ml36℃±1℃，18h~24hTSI，靛基质,尿素(pH7.2),KCN,赖氨酸，营养琼脂血清学鉴定血清分型（选）5.1预增菌•BPW（碱性蛋白胨水）：用于修复受损伤的沙门氏菌，但由于其不具有选择性，因此增菌时间过长会导致杂菌生长过多干扰鉴定结果(8-18h)。•如需调整pH,用1mol/mL无菌NaOH或HCl调pH至6.8±0.2。•经预增菌后的样品与选择性培养基约按1：10加入，例如1mL样品加入10mLSC和TTB中5.2增菌常用选择性肉汤比较SCTTB亚硒酸盐抑菌胱氨酸促生长四硫酸钠和煌绿抑菌尤其适合伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌生长，37℃适合其他沙门菌生长，42℃，18~24hr为防漏检宜SC+TTB转种前要“轻轻摇动”，考虑无鞭毛的沙门氏菌自然界中主要的杂菌为大肠埃希氏菌，而两者区别在于是否发酵乳糖，故常加入乳糖、酸碱指示剂两个指针来判断可疑菌落BS选择性最强，可延长时间以免沙门菌生长亦被抑制多采用BS搭配XLD/HE/显色平板，互补防漏检5.3分离指示系统指示效果及可疑菌落特点BS葡萄糖+H2S黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。XLD乳糖+H2S粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。HE乳糖+H2S蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。显色酶显色底物按照显色培养基的说明进行判定。5.4生化试验•生化试验1-克氏三糖铁（TSI）原理：三糖利用接种方法：穿刺划线结果：产酸／碱，产气，硫化氢•生化试验2-赖氨酸脱羧酶试验原理：细菌产生的脱羧酶可脱掉氨基酸之羧基，生成胺和CO2，使培养基PH升高，指示剂显色。结果：紫色为阳性，黄色为阴性•生化试验3–尿素酶原理：细菌产生的尿素酶分解尿素产生大量的氨，使培养基PH值升高，用酚红指示剂测出。结果：培养基变红为阳性，不变为阴性生化试验1-三糖铁试验（TSI）原理：三糖利用培养基：干粉或生化管接种方法：穿刺划线结果：产酸／碱，产气，硫化氢注意：高层斜面生化实验2-赖氨酸脱羧酶试验•目的：通过不同细菌对氨基酸之羧基的分解能力来鉴别细菌。•原理：细菌产生的脱羧酶可脱掉氨基酸之羧基，生成胺和CO2，使培养基PH升高，指示剂显色。•赖氨酸：经赖氨酸脱羧酶生成尸胺和CO2。•结果：检测培养基由黄色变紫色为阳性，黄色为阴性，对照（无氨基酸）为黄色。生化实验3-尿素酶试验目的：通过检测尿素酶来进行肠杆菌科细菌的鉴定原理：细菌产生的尿素酶分解尿素产生大量的氨，使培养基PH值升高，用酚红指示剂测出。结果：培养基变红为阳性，不变为阴性。生化实验4-硫化氢实验•目的：检测细菌对含硫化合物的分解能力•原理：细菌分解含硫氨基酸生成硫化氢与培养基中的铁或者铅离子生成黑色化合物。•方法：接种三糖铁琼脂或悬挂醋酸铅试纸。•结果：培养基出现黑色为阳性生化实验5-动力试验•原理：在半固体上穿刺接种后，细菌因具有鞭毛扩散生长•结果：阳性——扩散生长阴性——沿穿刺线生长•注意：培养基温度；剧烈运动可能出现假阳性结果生化实验6-氧化酶实验原理：细胞色素C对苯二胺+α萘酚吲哚酚蓝试纸片法操作：1、白金环取菌苔到试纸上2、加１滴生理盐水到试纸结果：阳性——３0秒内变蓝,阴性——不变色注意：避免含铁物质；空气易氧化生化实验7-糖苷醇类发酵试验不同细菌含发酵各种糖类的酶不同，分解糖类（糖醇类）的能力亦不同，根据分解不同糖类后产物的差异，来鉴定细菌。结果：若细菌分解糖类产酸，使培养基中的指示剂显酸性反应，颜色发生变化，若产气可使培养基中的导管或者琼脂出现气泡，无变化则说明阴性。说明：指示剂：酚红（黄红）、溴甲酚紫（黄紫）、溴麝香草酚蓝（黄蓝）注部分糖类灭菌需防止高温破坏。沙门氏菌:甘露醇,山梨醇阳性生化实验8-氰化钾实验原理:氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂,可与呼吸酶作用使酶失去活性,抑制细菌的生长,但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在时仍能生长,以此鉴别细菌.试验方法:取培养20～24h的营养肉汤培养液或菌落1环，接种至对照培养基及氰化钾培养基内，立即以橡胶塞塞紧，36±1℃培养24～48h，观察结果。结果记录:对照管有菌生长，试验管有菌生长为阳性。对照管有菌生长，试验管无菌生长为阴性。生化实验9-β-半乳糖苷酶试验(ONPG实验)目的：迅速及迟缓分解乳糖的细菌阳性，而不发酵乳糖的沙门氏菌为阴性。原理：细菌迅速分解乳糖是有β-半乳糖苷渗透酶和β-半乳糖苷酶，ONPG分子与乳糖相似所有乳糖快速发酵和迟缓发酵的细菌均可快速水解邻硝基酚-β-D-半乳糖苷结果：呈现黄色为阳性反应，通常20-30min内显色注意：为提高阳性反应速度，需大量接种培养物。过酸出现假阴性，过碱则出现假阳性。„使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定成套生化试剂盒试验的本质就是利用生化试验的方法，检测细菌对各种物质的代谢作用及其代谢产物，常用于细菌的鉴别。5.5血清学鉴定•试验原理•相应的抗原(细菌)与抗体(免疫球蛋白)在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。在微生物检验中，常用血清学反应来鉴定分离到的细菌，以最终确认检测结果。抗体攻击抗原（居中者）抗原-抗体-结合物沙门氏菌的抗原类型•O抗原（菌体）：O1…O67共58种，一种菌可能含1种或多种O-Ag，含相同O-Ag的归为一个血清群。有A、B、…Z、O57~63，O65~67，多为A~F群，故先要用此多价血清初筛•H抗原（鞭毛）：特异相（a~z，z1~z55），非特异性相（1，2…l，w），多为双相菌，可发生相位变异•Vi抗原（表面）：可阻止O与抗体反应，加热可消除玻片凝集法是一种常规的定性试验方法。用已知抗体来检测未知抗原。常用于鉴定菌种、血型。将含有致病菌抗体的血清与待检菌液各一滴，在玻片上混匀，数分种后若出现肉眼可见的凝集块，即为阳性反应，证明该菌是目标菌。此法快速、简便，但不能进行定量测定。先应在玻片上滴加1滴生理盐水，加入菌苔做阴性对照并观察是否自凝。5.5.1玻片凝集法操作•多价血清：含多种抗体的血清如A~F多价•抗原准备：多采用15g/L琼脂斜面培养物•若O血清不凝集可转种至高含量（2.5~3%）琼脂培基上，干燥利于O-Ag发育•若由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时,可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液,于酒精灯火焰上煮沸后再检查。•H抗原发育不良时,将菌株接种在0.55%~0.65%半固体琼脂平板，取菌落边缘部分检查;或将菌株通过接种装有0.3%~0.4%半固体琼脂的小玻管1次~2次,自远端取菌培养后再检查。5.6血清分型（选做）菌体抗原（O抗原）的检测A-F多价血清凝集O4O3,10O7O8O9O2O11O19O34O15O10B群？C1/C4群？C3群？E3群？E2群？E1群？E4群？D群？A群？F群？A-F多价血清不凝集采用9种多价血清逐一排查O多价1O多价2O多价3O多价4O多价5O多价6O多价7O多价8O多价9A~F群包括6，14群13，16，17，18，21群28，30，35，38，39群40，41，42，43群44，45，47，48群50，51，52，53群55，56，57，58群59，60，61，62群63、65，66，67A~F群常见菌型鞭毛抗原（H抗原）表O群ABBC1C2D不产气D产气E1E4E4第一相ag,f,si,b,dk,v,r,cb,d,rdg,m,p,qh,vg,s,tI第二相//25,Z152,5//6,w,x/结果与报告•综合生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g（mL）样品中检出或未检出沙门氏菌。致病菌检测的常规流程使目标菌增殖到可检测的水平得到目标菌的单克隆确定目标菌的种属时间温度谢谢大家