FISH以及免疫荧光的实验步骤

FISH一、当已知某个基因定位在细胞核中，而要知道它具体定位在细胞核的什么位置（或者染色体的具体位置）则需要制备中期相细胞。因为只有中期相的染色体是最利于观察的。具体操作如下：染色体FISH以及免疫荧光I、细胞处理1、在头一天晚上铺板6cm板（到第二天下午开始做实验，这时的细胞是生长活性比较旺盛的），在实验之前3个小时加秋水仙素（使得终浓度为0.5ug/ml）（短时程高浓度秋水仙素使大量细胞处于中期相）2、用胰酶消化细胞，然后用6ml75mMKCl重悬细胞（低渗溶液，使细胞充分吸水膨胀，但是又不会胀破，最好现配现用，用前37℃预热），37℃水浴锅30min。（这一步非常关键，KCl的用量是适细胞量来加的，对于6cm板的细胞一般加6ml，不过一般一个6cm板的细胞就够滴很多个片子了，一般在低渗的过程中是不会有细胞沉淀的，否则就是低渗液太少了，如果低渗液加的太少细胞膜无法打开，则滴片效果大大降低）3、加入1ml固定液，200g5min。4、用5ml固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）重悬细胞（固定），室温30min，期间混匀一次细胞。5、重复步骤4一次6、200g5min，用500ul固定液重悬细胞。II、探针制备1、T载质粒构建2、质粒酶切，如果用T7promoter转录就用NdeI酶切，如果用Sp6promoter转录就用sacII酶切。3、酶切产物直接回收。以这个产物为模板，按照ThermoT7转录试剂盒转录出RNA4、RNA纯化（加入1/10的3M醋酸钠，2倍体积的无水乙醇）-80℃20min5、12000rpm10min，去上清，加入1ml75%的乙醇。6、7500rpm5min，去上清，干燥，用适量DEPC水溶解。7、取15ugRNA（加入1/10的3M醋酸钠，2倍体积的无水乙醇）-80℃20min8、12000rpm10min，去上清，加入1ml75%的乙醇。9、7500rpm5min，去上清，干燥，用20ullablingbuffer溶解。10、95℃5min，立即冰上冷却5min11、加入5ulUlS染料（一旦开始加入染料之后，所有操作都应该避光）12、90℃10min，立即冰上冷却5min。（加入1/10的3M醋酸钠，2倍体积的无水乙醇）-80℃20min13、12000rpm10min，去上清，加入1ml75%的乙醇。14、7500rpm5min，去上清，干燥，用20ul~30ulDEPC水溶解。III、铺片1、先将载玻片放在黄色玻片盒里，然后放进-80℃冰箱冷却。（超低温可以使得染色体充分的炸开）2、将预冷的玻片45度放在地上，然后从高空滴下细胞（50ul每滴）到玻片上。（吸细胞的枪头用剪刀剪掉前端）3、然后迅速用吹风机吹干，并在酒精灯上过三下（使细胞更好的贴附在玻片上）然后放进无水乙醇中5min,再放进2*SSC5min，（不能放进2*SSC5min,再放进无水乙醇中5min，因为在杂交过程中酒精是大忌，它会严重影响杂交效果）然后迅速用吹风机吹干。4、取15ul探针与15ul杂交液（探针：杂交液=1:1，在吸杂交液的时候，枪头用剪刀剪掉前端，慢慢的吸出，杂交液很黏）1:1混合，然后分三滴滴在玻片上。盖上盖玻片。5、将一个锡箔纸放在金属浴上（使受热均匀），然后玻片放在锡箔纸上，80℃10min。（变性）6、事先将黑盒子洗干净，然后配置湿液（4*SSC：甲酰胺=1:1），将其倒入黑盒中37℃培养箱中预热。7、将第五步的玻片放入黒盒中，37℃杂交过夜。（如果背景过高，可以将杂交温度提高到42℃）8、将盖玻片用小刀揭掉，在2*SSC中洗一次，5min（为了降低背景，洗掉杂信号，可以将洗涤液即2*SSC可以45摄氏度预热），不要过多洗涤，不然会将染色体洗掉9、敷一抗（抗体：1%BSA=1:200）每个片子用150ul即可覆盖整个片子。然后用封口膜覆盖整个片子。放在黑盒子里4℃24h10、用镊子撕掉封口膜，2*SSC中洗三次，每次5min。敷二抗（抗体：1%BSA=1:100）每个片子用150ul即可覆盖整个片子。然后用封口膜覆盖整个片子。放在黑盒子里4℃12h。11、2*SSC中洗两次，每次5min。吸干之后加入DAPI，5min，然后加入2*SSC，立即吸干，再加入2*SSC洗5min，吸干并吹干，然后制片。显微镜观察。二、如果只是鉴定某个基因是定位在细胞核还是细胞质，则将细胞用胰酶消化离心之后用5ml1*PBS重悬，然后慢慢滴入1ml固定液（预固定），立即200g5min，用5ml固定液重悬细胞（固定），室温30min，期间混匀一次细胞。200g5min，用5ml固定液重悬细胞（固定），室温30min，期间混匀一次细胞。200g5min，用500ul固定液重悬细胞，后面步骤同上。在后面铺片的时候是涂片而不是滴片，即将细胞用枪头涂在玻片上（玻片不用冷却），然后迅速吹干，并在酒精灯上过三下。细胞免疫荧光1、双阻断法爬片制备后期相细胞（终浓度为5mM胸腺嘧啶处理16h，吸去旧培液，用1*PBS洗4次，加入新培液，9h后，加入胸腺嘧啶使终浓度为5mM，处理16h，吸去旧培液，用1*PBS洗4次，加入新培液，9h后固定）2、将片子挖出，放入固定液中固定5min3、1*TBST洗3次*5min4、0.1%TritonX-100/TBS处理5min（破细胞膜，使细胞质中可溶性的蛋白释放出来，并且洗掉一些细胞质中的杂蛋白）5、0.1%Tween20/TBS洗2次*5min6、1%BSA（称1gBSA溶解于100mlTBST中）室温30min~1h7、将片子挖出，然后将多余的液体吸干，加入一抗（一抗：1%BSA=1:100稀释）4℃2h，再室温2h8、0.1%Tween20/TBS洗3次*5min9、加入二抗（二抗：1%BSA=1:100稀释，避光，因为二抗有荧光基团），4℃1h，再室温1h10、0.1%Tween20/TBS洗3次*5min11、DAPI然5min12、0.1%Tween20/TBS洗2次*5min13、吹干，制片，镜检，观察。（TritonX-100与Tween20都是属于去污剂，用于破坏细胞膜，但是TritonX-100比Tween20的作用强）