第9章-发酵产物的提取与分离

第9章发酵产物的提取与精制•发酵液下游加工是指从发酵产物中分离、纯化产品的过程，是利用产物和杂质的物理化学性质不同提取产物或者从系统中去除杂质的操作。9.1概述•1．发酵液的一般特性•（1）发酵产物浓度较低，属于稀水溶液系统。•（2）成分复杂，含有目的产物、微生物细胞碎片、其他代谢副产物、残留培养基、无机盐等。•（3）含有色素、热源物质、毒性物质等有机杂质。•（4）发酵产物稳定性低，对热、酸、碱、有机溶剂、酶、机械力等敏感，不适宜条件下易失活或分解。2．提取和精制•提取和精制是为了从发酵液中获得高纯度的、符合质量标淮要求的发酵成品。•发酵产物存在形式不同，用途各异，产品质量要求不同，分离纯化步骤有所不同。•但大多数包括以下四个步骤：发酵液预处理和菌体分离、提取、精制、成品加工。发酵产品后处理过程流程图•发酵液预处理和菌体分离是采用凝聚和絮凝等技术，加速固液分离，提高过滤速度。如果是胞内产物，首先要进行细胞破碎，再分离细胞碎片。•初次纯化即提取，主要是除去与目标产物性质有很大差异的物质，浓缩产物，提高产品质量。常用方法有沉淀、吸附、萃取等。•高度纯化即精制，采用对产品有高度选样性的分离技术，除去与产物理化性质相近的杂质。典型的方法有层析、离子交换等。•成品加工是为了获得质量合格的产品，常用浓缩、结晶、干燥等技术方法。9.2发酵液的预处理及菌体分离•发酵液预处理及菌体分离是下游加工的第一步操作。•目的是改善发酵液的性质，去除部分可溶性杂质，分离菌体和其他悬浮颗粒，以利于提取和精制工序的操作。•预处理中常用酸化、加热、加絮凝剂、过滤、离心等方法。1．发酵液的预处理•杂质直接影响产品质量和收得率，对提取和精制也有很大影响，特别是高价无机离子和杂蛋白等。•高价无机离子会影响树脂对生化物质的交换容量。•杂蛋白降低树脂的交换容量和吸附能力，溶剂萃取时引起乳化，堵塞过滤介质，或使滤膜受到污染。•（1）高价无机离子的去除：发酵液中主要的无机离子有Ca2+，Mg2+，Fe3+等。•钙离子常使用草酸去除。•Mg2+可加入三聚磷酸钠，它和Mg2+形成可溶性络合物，可消除对离子交换的影响。•Fe3+用黄血盐(亚铁氰化钾)反应生成普鲁士蓝沉淀除去。（2）杂蛋白的去除：•①沉淀法：利用蛋白质等电点进行沉淀，或在酸碱性条件下加入阴离子阳离子进行沉淀，或加入中性盐破坏蛋白质水化层进行沉淀。•②变性法：加热变性、酸碱变性、有机溶剂变性等。•③吸附法：吸附剂和沉淀剂的吸附作用。•（3）色素及其他物质的去除•常用的脱色方法有离子交换剂、离子交换纤维、活性炭等材料吸附。2．离心过滤与菌体分离•菌体分离通常采用离心分离和过滤两种方法。•离心分离是在离心力场的作用下，将悬浮液中的固相与液相加以分离，多用于颗粒较小的悬浮液和乳浊液的分离。•离心方法有差速离心法、密度梯度离心、等密度离心、平衡等密度离心。•细菌和酵母菌发酵液多采用离心分离。•霉菌和放线菌多采用过滤分离。•过滤的原理是悬浮液通过过滤介质时，固态颗粒与溶液分离。•根据机理，过滤可分为澄清过滤和滤饼过滤。•澄清过滤中，过滤介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭、烧结陶瓷、烧结金属等，它们填充在过滤器内构成过滤层，悬浮液通过滤层时，固体颗粒被滤层颗粒阻拦或吸附，滤液得以澄清。•滤饼过滤中，过滤介质为滤布。悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布阻挡而逐渐形成滤饼。滤饼至一定厚度时即起过滤作用。（1）影响发酵液过滤的因素•发酵液属非牛顿性液体，粘度大，过滤速度慢。•过滤速度与菌体细胞体积、发酵条件、未利用完的培养基浓度、消沫剂、发酵周期等有关。（2）改善发酵液过滤性能的方法•发酵液难过滤时，需改善过滤性能，降低滤饼比阻，提高过滤与分离的速率。•改善发酵液性能的方法有调酸、热处理、添加凝聚剂、反应剂、助滤剂等。•①调pH：除去蛋白质等两性物质，改变易吸附分子的电荷性质，减少滤膜堵塞和污染。•②凝聚与絮凝：形成较大絮团，减少堵塞。•③吸附剂法：将细菌吸附在吸附剂上，形成较大的颗粒，减少堵塞。•④助滤剂法：助滤剂如硅藻土吸附细菌细胞改变滤饼结构，降低过滤阻力，加快过滤速度。3．细胞破碎与分离•微生物的代谢产物如果是胞内物质（如有些酶制剂、干扰素、胰岛素等），那么首先要收集菌体，进行细胞破碎。•（1）微生物细胞壁的组成与结构：•①细菌细胞壁：肽聚糖。•②酵母菌细胞壁比G+菌稍厚，主要成分是葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质等。•③其他真菌细胞壁主要由多糖组成，如几丁质或纤维素强度比细菌和酵母菌高。（2）常用的细胞破碎方法•细胞破碎的方法很多，根据外加作用力的方式可分为机械法和非机械法两大类。•前者有珠磨法、高压匀浆法、超声波法、X-press法；•后者有酶解法、化学法、物理法、干燥法等。•①机械法：•高压匀浆法是利用高压使细胞悬液通过针型阀，由于突然减压和高速冲击撞击环，造成细胞破碎；•X-press法或Hughespress法是一种改进的高压法，其操作方法是将浓缩的菌体悬浮液冷冻至-25℃~-30℃形成冰晶，利用500Mpa以上的高压冲击，将冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。由于冰晶体的磨损，造成包埋在冰晶体中的微生物变形而引起细胞破碎。•此方法适用范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低，活性保留率高。但是不能用于对冷冻融解敏感的生物物质。•超声波法是利用超声波的空穴作用使细胞破碎，由于这种空穴泡又受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由此引起的黏滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，造成细胞破碎。•超声波振荡容易引起温度的剧烈上升，所以操作时可以在细胞悬浮液中投入冰块或在夹层中通人冷却水进行冷却。•②非机械法：•酶解法是利用酶反应分解破坏细胞壁成分的特殊化学键，达到使细胞破碎的目的。分为外加酶法和自溶法（常采用加热或干燥法）。•渗透压冲击法是将细胞先放入高渗透压的介质中，在达到平衡后，介质被突然稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，水就会迅速进入细胞内，致使细胞膨胀，引起细胞壁的破裂。•反复冻融法是将细胞反复在低温下突然冷冻后在室温下融化，最后引起细胞破碎。•低温冷冻使细胞膜的疏水键结构断裂，增加细胞亲水性能；同时胞内水结晶使细胞内外溶液浓度发生变化，引起细胞突然膨胀而破裂。•可采用此法处理细胞壁较脆弱的菌体，但通常破碎率较低，有时即使反复如此处理仍不能提高破碎率。•此外还可能引起对冻融敏感的蛋白质变性。•干燥法可采用空气于燥、真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等。•干燥过程能使细胞膜渗透性改变，再用丙酮、丁醇或缓冲液等处理时，胞内物质就容易被抽提出来。•（3）细胞碎片的分离：常用离心分离法。•近年来利用双水相萃取法，使生物大分子或细胞碎片在两相或多相中进行不同的分配，达到分离的目的。•另外，向细胞碎片悬浊液中加入某种固体吸附剂，或使悬浮液通过装有吸附剂的固定床，也可达到去除细胞碎片的目的。9.3发酵产物的提取和精制•1．沉淀法•通过改变条件或加入某种试剂，使发酵产物离开溶液，生成不溶性颗粒而沉降析出的过程。•沉淀法浓缩作用大于纯化作用，是初步分离的一种手段。•沉淀法具有设备简单、成本低、原料易得、收率高、浓缩倍数高和操作简单等优点，不足之处在于过滤困难、产品质量较低、需要重新精制。•（1）等电点沉淀法：利用两性电解质在电中性时溶解度最低的原理进行分离纯化。在低离子强度下，调节至等电点，可使各种两性电解质所带净电荷为零，能大大降低其溶解度。•不同的两性电解质具有不同的等电点，从而将其分离开。•优点是许多蛋白质的等电点都在偏酸性的范围内，而许多无机酸价格低廉，并能为食品标准允许，因此常可无须除掉残余的酸，而直接进行下一步纯化操作。•缺点是酸化时，容易引起蛋白质失活。不少蛋白质与金属结合后等电点会发生偏移。•（2）盐酸盐法：在发解液中加入盐酸，使氨基酸成为氨基酸盐酸盐析出，再加碱中和到氨基酸的等电点，使氨基酸沉淀析出。•（3）金属盐法：在发酵液中加入重金属盐，使难溶的氨基酸金属盐沉淀析出。沉淀经溶解后，调pH值至氨基酸等电点，使氨基酸沉淀析出。•谷氨酸提取①等电点——锌盐法：谷氨酸与硫酸锌(ZnSO4·7H2O)，生成谷氨酸锌盐沉淀。②钙盐法提取谷氨酸：等电点锌盐法钙盐法提取谷氨酸工艺流程•（4）有机溶剂沉淀法：许多有机溶剂如丙酮、乙醇、甲醇等能使溶于水的小分子生物物质以及核酸、多糖、蛋白质等生物大分子发生沉淀作用。•这种沉淀作用主要是由于水溶液介电常数降低、静电引力增大，带电溶质互相吸引凝集。•具有水化层的生物分子，有机溶剂与水的作用，使得这些分子脱水而相互聚集析出。•优点是分辨能力比盐析法高，一种溶质只在一个比较窄的有机溶剂范围内沉淀；沉淀不需脱盐；有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，容易进行固液分离；而且有机溶剂容易蒸发，不会在成品中残留，因此适用于食品、药品的制备。•其缺点是容易引起蛋白质变性失活，并且有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。•（5）盐析法：在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐后，盐离子在水中发生水化，使蛋白质脱去水化膜层，暴露出疏水区域，疏水区域相互作用使蛋白质沉淀；同时中性盐的解离，中和蛋白质所带电荷，使蛋白质分子间排斥作用减弱而相互聚集。•中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠等，生产上常用硫酸铵。•其优点是成本低、操作简单、安全和对许多生物活性物质具有稳定作用。•（6）非离子型多聚物沉淀：可用于选择性沉淀从而纯化蛋白质，应用最多的是聚乙二醇(PEG)。•作用机制有几种假设：多聚物与有机溶剂相似，能降低水化度使蛋白质沉淀；与大分子形成复合物，发生共沉淀作用等。•优点：操作条件温和，不易引起生物大分子变性，沉淀效果好，沉淀后的多聚物容易除去，广泛应用于核酸、蛋白质、细菌和病毒等的分离纯化。2．膜分离技术•其实质是物质通过膜的传递速度不同而得到分离。•优点：过程一般较简单，操作方便，费用较低，效率较高，无相变，可在常温下操作，既节能又特别适用于热敏性物质的分离纯化。（1）膜分离技术分类•①透析：是利用膜两侧浓度差，使溶质从浓度高的一侧，通过膜孔扩散到浓度低的一侧，从而实现分离的过程。•②电渗析：是一种以电位差为推动力，利用离子交换膜选择性地使阴离子或阳离子通过的性质，达到从溶液中分离电解质目的。•③微滤：微孔过滤，利用孔径0.025μm~14μm的多孔膜，过滤含有微粒的溶液，将微粒从溶液中除去，达到净化、分离和浓缩的目的。推动力为压力差，通常为0.1MPa~0.5MPa。•④超滤：滤膜孔径为1nm~20nm，用于过滤含有微粒和大分子的溶液。以压力差为推动力，通常为0.1MPa~0.6MPa。•⑤反渗透：用反渗透膜(孔径0.1nm~1nm)，对溶液施加压力，使溶剂通过反渗透膜，截留所有可溶物而得到分离的操作。反渗透也是以压力差为推动力，操作压达3MPa~10MPa。•⑥纳米过滤：以压力是为推动力，用纳米过滤膜(孔径约2nm)，从溶液中分离出相对分子质量300~1000的物质的膜分离过程。特点是：在过滤分离过程中，能截留小分子有机物，同时透析出盐，达到浓缩和透析目的；操作压力低，节约动力。3．萃取法•萃取是将某种溶剂加入到液体混合物中，根据混合物中不同组分在溶剂中溶解度的不同，将所需要的组分分离出来。•液-液萃取也称溶剂萃取，其优点是：比化学沉淀法分离程度高；比离子交换法选择性好、传质快，比蒸馏法能耗低，生产能力大，周期短，便于连续操作，容易实现自动化控制等。•（1）溶剂萃取：是利用萃取目标物质在两种互不相溶的溶剂中溶解度的不同，使其从一种溶剂转入另一种溶剂从而实现分离。•萃取步骤包括：混合→分离→回收溶剂。•萃取操作流程分为单级萃取和多级萃取，多级萃取又分为多级错流萃取和多级逆流萃取。•①单级萃取：只使用一个混合器和一个分离器的萃取。流程最简单，收率不高。•②多级错流萃取：每级都加入新鲜萃取溶剂，溶剂消耗多，萃取液产物平均浓度较稀，但萃取较完全。•③多级逆流萃取：料液走向与萃取走向相反，萃取剂只在最后一级加入，萃取剂消耗少，萃取液产物平均浓度高，产物收率最高。多级错流萃取（F料液；S溶剂