NK细胞培养SOP

第1页NK细胞制备与培养标准操作流程1目的与范围：1.1目的：规范NK细胞培养操作流程，保证NK细胞产品制备的稳定性、均一性。1.2范围：适用于本实验室细胞培养技术人员对NK细胞培养的全过程。2文件：2.1NK细胞制备与培养标准操作流程3记录：3.1NK细胞制备与培养记录表、操作1间清场记录表4试剂、耗材与仪器设备：4.1试剂：75%酒精、D-PBS缓冲液或生理盐水、淋巴细胞分离液、AMMS无血清培养基、自体血清、A/B/C/D/E因子、IL-2。4.2耗材：T175培养瓶、1.5L培养袋、15ml离心管、50ml离心管、50ml一次性注射器、5ml一次性注射器、1ml一次性注射器、10ml移液管、1ml枪头、200ul枪头、10ul枪头、巴斯德滴管、0.2mlEp管、0.22um一次性过滤器。4.3仪器设备：超净工作台、离心机、倒置显微镜、CO2培养箱、第2页水浴锅、电动移液枪、1ml手动移液枪、200ul手动移液枪、医用剪刀、医用止血钳、试管架、50ml注射器支架、托盘。5工作程序：5.1实验前准备：5.1.1洁净区需经紫外线照射，连续照射时间≥30min，实验室共作过程中风机始终保持开启运行状态。5.1.2超净工作台需经过开机紫外线照射，照射时间≥30min，开机风机运行≥10min。开启超净工作台玻璃防护窗，待超净工作台内部气流稳定后才可使用。5.1.3将实验室所需的器械、耗材放于物料传递窗进行紫外线照射≥30min（器械与各规格的移液枪头必须经过高温高压灭菌锅消毒灭菌，且在合格期内），照射完毕后将器械包与所需耗材用75%酒精纱布擦拭外包装消毒后放入超净工作台内备用。5.1.4将淋巴细胞分离液、AMMS无血清培养基、PBS缓冲液或生理盐水提前30min从4℃冰箱取出，用75%酒精纱布擦拭后放入超净工作台，恢复至室温备用。5.1.5A/B/C/D/E因子、IL-2在使用时提前10min从-20℃冰箱取出，即用即取，禁止在常温状态下长期放置。5.1.6将所需T175培养瓶、50ml离心管、15ml离心管、50ml一次性注射器、10ml移液管、1ml移液枪头、200ul移液枪头经过酒精擦拭后放入超净工作台备用。第3页5.2试剂配制：5.2.1配制要求：实验室所有试剂配制应在超净工作台内，按照试剂说明书或按照实验室细胞培养要求配制试剂。5.2.2NK细胞培养基配制：5.2.2.1完全培养基：AMMS无血清培养基+5%自体血清5.2.2.2活化培养基：AMMS无血清培养基+IL-2（终浓度为1000IU/ml）5.2.3细胞因子配制：将因子B/C/D/E从4℃冰箱取出，打开后，用1ml移液枪注入1ml活化培养基使其充分溶解后吸出备用，再用1ml培养基冲洗西林瓶，以减少最大损耗。5.3T175培养瓶包被预处理（第-1天）5.3.1用移液枪将NK试剂A全部转移到事先备有的装有12.5mlD-PBS的15mL离心管中，充分混匀30s-1min后将溶液全部转移入T175培养瓶中，轻轻摇晃使其均匀铺满底部，4℃冰箱平放过夜。（注意：第一次吸取试剂A原液后，可再用适量PBS冲洗西林瓶洗出残留原液，以最大程度减少损耗）5.3.224h后取出，直接吸弃包被液，无需清洗即可使用。6分离提取PBMC（第0天）：6.1制备血浆：6.1.1将装有全血的采血管用酒精擦拭外表面消毒后放入超净工作台内，打开采血管盖子，将全血倒入至事先备好的50ml第4页离心管中，一共2支，每管25ml。6.1.2室温2000rpm，离心10min（离心机升降速：升9降4）。6.1.3离心完毕后，从离心机中拿出离心管，用75%酒精纱布擦拭离心管外表面消毒，放入超净工作台内，用电动移液枪吸取上层血清至50ml离心管中，灭活（56℃水浴锅中水浴30min，4℃放置30min），剩余下层血细胞备用。6.1.4将灭活好的血清2800rpm离心8min，离心完毕后，将上清分于3支15ml离心管中，-20℃冰箱保存。6.2提取PBMC：6.2.1将生理盐水袋用75%酒精纱布擦拭消毒后放入超净工作台内，再用75%酒精纱布对生理盐水袋口进行擦拭消毒后，用医用剪刀剪去袋口。6.2.2用生理盐水对6.1.3剩余的下层血细胞进行稀释，稀释比例按生理盐水:血细胞=1.5:1，最后将稀释好的血细胞重悬、混匀备用。6.2.3根据稀释后的血细胞体积，在另一个50ml离心管加入对应体积的淋巴细胞分离液，将稀释、混匀的血细胞悬液缓慢加入到装有淋巴细胞细胞分离液的50ml离心管中（即淋巴细胞分离液:稀释的血细胞悬液=1:1）。6.2.3.1操作方法：可将离心管倾斜45°，用电动移液枪吸取血细胞悬液，沿离心管壁缓慢滴加在淋巴细胞细胞分离液表面，滴加完毕后，缓慢竖立离心管（不要打乱液面第5页界面），加入总体积不超过45ml，室温，2500rpm，离心20min（注意：调整离心机的升降速为最低，调整电动移液枪输出速度最低）。6.2.4离心完毕后，小心取出离心管，可见清晰的细胞分层，用75%酒精纱布擦拭离心管外表面消毒后放入超净工作台。（注意轻拿轻放，保持离心管竖直放置，以免破坏细胞分层）。6.2.5用巴斯德滴管或1ml移液枪缓慢插入离心管中，沿管壁提取淋巴细胞分离液与血浆层交界处的白膜层，将提取的白膜层细胞加入到备用的50ml离心管中，补充生理盐水至45ml，混匀，1500rpm，离心5min。6.2.6离心完毕后，取出离心管，用酒精纱布擦拭离心管外表面后放入超净工作台内，倒掉上清，补充生理盐水至45ml重悬，1000rpm，离心10min（步骤6.2.6重复两次）。6.2.7待步骤6.2.6第二次离心完毕后，取出离心管，外表面用75%酒精纱布擦拭消毒后放入超净工作台内，取足量上清至15m离心管中，做上标记，送微生物检测并留样（检测内容：细菌、霉菌、内毒素、衣原体、支原体），剩余上清弃去，离心管底部剩余细胞用10mL活化培养基重悬，计数。6.3细胞接种：6.3.1根据计数结果将细胞浓度调整为1-2×106个/mL（最优为第6页1.5×106个/mL），用适量活化培养基冲洗离心管并转移入T175包被培养瓶中，以减少细胞损耗。（注意：包被瓶取出时间为细胞加入前5min，其他时间需在4℃放置保存）6.3.2并补加NK试剂B，患者灭活血浆1.25mL（5%）确保瓶中培养基终体积为25mL左右，拧紧培养瓶盖，“8”字轻微摇晃培养瓶，使细胞悬液均匀的铺满培养瓶底部，水平放入37℃、5%CO2培养箱中培养。（剩余血浆4℃密封保存备用）7NK细胞扩增培养：7.1第一次补液（第3天）：取出培养瓶，用75%酒精纱布擦拭外表面消毒后放入超净工作台内，取出事先溶好的NK试剂C，用1ml移液枪吸出后加入培养基中，同时补加5%的患者灭活血浆至75ml，充分混匀后竖直放入37℃、5%CO2培养箱中培养。（注意：请勿吹打细胞）7.2第二次补液（第5天）：取出培养瓶，用75%酒精纱布擦拭培养瓶外表面消毒后放入超净工作台内，取出事先溶好的NK试剂D，用1ml移液枪吸出后加入培养基中，同时补加5%的患者灭活血浆至250ml，充分混匀后竖直放入37℃、5%CO2培养箱中培养。（注意：请勿吹打细胞）7.3第三次补液及其转袋（第7天）：第7页7.3.1取转袋所需的50ml一次性注射器、5ml一次性注射器、托盘、培养袋与注射器支架，经酒精擦拭消毒后放入超净工作台备用。7.3.2将50ml注射器针头及助推器弃去，放入到注射器支架的圆口内，用75%酒精纱布擦拭培养袋导管盖子下1-2cm处，擦拭消毒两次，用医用止血钳取下培养袋前端盖子，连接导管口与注射器口。7.3.3从CO2培养箱取出T175培养瓶，用75%酒精纱布擦拭外表面后放入超净工作台内，打开T175培养瓶盖，将T175培养瓶中细胞悬液缓慢倒入注射器内，待培养瓶中细胞悬液倾倒完后，可往培养瓶中倒入5ml活化培养基进行涮洗，用移液枪轻轻吹打培养瓶底部（切勿剧烈吹打），将涮洗的细胞悬液同样按上述方法倒入培养袋中。7.3.4待细胞悬液转袋完毕后，按照上述方法同时补加活化培养基，NK试剂D及剩余的全部患者灭活血浆至750ml。7.3.5待细胞悬液及添加因子转袋完毕后，用医用止血钳夹紧培养袋导管前端，将导管与注射器分离并将导管抬高，确保细胞悬液全部进入培养袋后，用止血钳将导管盖子盖上并拧紧，用塑料夹夹紧导管末端。7.3.6将培养袋平放，用双手轻按培养袋，使细胞与培养基混匀。用酒精擦拭培养袋取样口，培养袋标记后双手托住培养袋下方放入托盘中，送至37℃、5%CO2培养箱中培养。第8页7.4第四次补液（第9天）：主要为分袋操作。7.4.1准备一新的未使用的培养袋来，将50ml注射器针头及助推器弃去，放入到注射器支架的圆口内，用75%酒精纱布擦拭培养袋导管盖子下1-2cm处（两次），用医用止血钳取下培养袋前端盖子，连接导管口与注射器口。7.4.2从培养箱中取出培养袋，用75%酒精纱布擦拭培养袋外表面后放入超净工作台内，并挂于超净工作台内的挂钩上。双手轻轻按压培养袋，使培养袋中的细胞悬液混匀，用止血钳夹紧培养袋导管，用75%酒精纱布对导管口1-2cm处进行擦拭消毒，并拧开培养袋导管盖子。7.4.3轻轻按压培养袋，使袋中的细胞悬液缓慢匀速经由导管流入注射器内，当转入新袋的细胞悬液体积达到约为375ml时，将导管口抬起，使导管内的细胞悬液回流至旧培养袋中，用止血钳将导管前端夹紧，置于工作台内。7.4.4按照步骤7.3.2-7.3.6的方法分别往两个培养袋中补充添加活化培养基，至终体积为750ml。7.4.5补液完毕后，将培养袋平放，用双手轻按培养袋，使细胞与培养基混匀。用酒精擦拭培养袋取样口，培养袋标记后双手托住培养袋放入托盘内，送至培养箱中培养。7.5第五次补液（第12天）：主要为补液操作，按照步骤7.3.2-7.3.6的方法分别往两个培养袋中补充添加剩余的活化培养基，至终体积为1000ml。第9页8细胞回输（第13/14天）：8.1细胞收获：8.1.1检查NK培养袋标记是否与回输计划相符。取出培养袋，用75%酒精纱布擦拭培养袋外表面后放入超净工作台内，并挂于超净工作台内的挂钩上。8.1.2取8个250ml离心瓶，标记，打开离心瓶盖子，整齐摆放于工作台内，将离心瓶刻度面向操作者。8.1.3混匀培养袋中的细胞悬液，用止血钳夹紧培养袋导管，用75%酒精纱布对导管口1-2cm处进行擦拭消毒，并拧开培养袋导管盖子。左手握住止血钳，右手拿住导管，慢慢松开止血钳，由慢到快将培养袋中的细胞悬液引入到离心瓶内，当需要换离心瓶时，只需左手捏紧止血钳，右手将导管放至新的离心瓶口即可。8.2细胞清洗8.2.1用75%酒精纱布擦拭生理盐水袋外表面后放入超净工作台内，并对生理盐水袋口进行两次擦拭消毒，用医用剪刀剪开消毒过的袋口，备用。8.2.2将上述收集的细胞悬液，1200rpm，离心8min。待离心完毕，取出离心瓶，用75%酒精纱布擦拭离心瓶外表面后放入超净工作台内，将上清倒入事先备好的无菌密闭容器内（收集贮存），离心瓶中添加50ml生理盐水重悬、混匀。8.2.3将重悬的细胞收集到四个250ml离心瓶中，剩余的两个离第10页心瓶可每瓶用20ml生理盐水涮洗，将涮洗的细胞悬液也倒入收集的两个离心瓶中重悬、混匀，1200rpm，离心8min。8.2.4待离心完毕，取出离心瓶，用75%酒精纱布擦拭离心瓶外表面后放入超净工作台内，倒掉上清，离心瓶中添加100ml生理盐水重悬、混匀，1200rpm，离心8min（注意:此骤重复2-3次，且最后一次离心前按照步骤11.2.4方法将两个离心瓶中的细胞收集到一个离心瓶内）。8.2.5待离心完毕，取出离心瓶，用75%酒精纱布擦拭离心瓶外表面后放入超净工作台内，往15ml离心管内倒入10ml上清，标记，做霉菌、内毒素、支原体、衣原体检测并留样，多余上清倒掉。离心瓶内留下的NK细胞用生理盐水20ml重悬，取20ul中间层细胞悬液计数及活率检测。8.2.6根据计数及活率检测结果，调整NK细胞浓度为1~2x106，