SOP-QM-8190-03菌种传代、保存、使用、销毁标准操作规程

第1页共7页山东鲁西药业有限公司GMP文件题目菌种传代、保存、使用、销毁标准操作规程新订修订√文件编码编制部门质量部制定人审核人批准人制定日期年月日审核日期年月日批准日期年月日颁发部门QA办生效日期年月日分发部门质量部目的：建立检定用菌种的管理制度，规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。范围：本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等。责任：QC主管负责菌种的申购、接受、保存、分发；微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。1、定义：标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。2、规程：2.1QC主管每年根据检定菌种的使用情况（包括临时检验需要），提出购买计划，交由质量管理部部长审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌种）或传代用菌种，菌种购买时，需询问与确定菌种的代数，以便传代时控制代数。2.2菌种到达实验室后，由QC主管接收菌种，检查其名称和数量以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息填写在《检定菌接收记录》（附表1）上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于4-8℃冰箱中，在一周内必须完成转种。第2页共7页2.32.3.1工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4-8℃冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而不同：细菌1个月；霉菌及酵母菌2个月；芽胞3个月。2.3.2采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。2.3.2.1用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面的菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装入试管中的无菌纯化水中，调整菌液浓度，使其等同于10号比浊管。向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油（浓度20%）即为10%甘油菌悬液，轻轻振摇，使内容物充分混合，分装于无菌小试管，在-30℃冷冻条件下保存。此甘油冷冻管为第2代（G2），使用有效期为一年。使用时取出一支放至室温，转种增菌培养或接种至琼脂斜面复苏，挑取纯菌落传代或工作用。伤寒沙门菌。2.3.2.22.3.2.2.1皮纸包好，在121℃灭菌30分钟,置40℃恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用。2.3.2.2.2养结束后，在层流台下用无菌吸管吸取上述无菌液体石蜡至培养好的菌种管内，并使石蜡高出菌种表面约1cm使菌体与空气隔绝，并将试管直立，置于-20℃冷冻或2-8℃冰箱中保存。此法主要适用于霉菌、厌氧菌、放线菌、芽孢杆菌的保存（如枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌等）。2.3.3限》（附件1）。2.4检定菌菌种的传代因冻干菌(标准菌种)与传代用菌种而不完全相同。第3页共7页2.4.12.4.1.12.4.1.1.1(1ml)、双碟、镊子、TSB培养基(或其它适宜培养基)数支，移入阳性对照室的超净工作台或生物安全柜。2.4.1.1.275%乙醇棉球擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将标准菌种管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌毛细滴管吸取TSB培养基(或其它适宜的培养基)，滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷而炸裂。2.4.1.1.31支灭菌毛细滴管，在火焰旁吸取TSB培养基(或其它适宜的培养基)少许,加至菌种管底部将冻干菌块搅动促使溶解,随即吸出管内菌液,接种至TSB培养基(或其它适宜的培养基)内,并根据不同菌种类型而将其培养于相宜的温度下24-72小时(细菌需要24-48小时的培养物，酵母菌需要72小时的培养物，形成孢子的微生物则宜保藏孢子，放线菌和丝状真菌则应培养7-10天）。最后将毛细滴管及菌种管经高温灭菌（121℃，45分钟）。2.4.1.1.4浊，在将其作为无活菌生长的培养物丢弃以前，细菌应至少培养1周以上，真菌和酵母菌至少应培养2周以上，并在丢弃之前应高温灭活处理（121℃，45分钟）。2.4.1.22.4.1.2.1然后在30-35℃下培养3天（细菌）；20-25℃下培养5天（真菌和酵母菌）。培养后，首先观察其是否具有典型的菌落形态，然后挑取生长旺盛的单一的纯菌落，划线于平皿培养基。每种菌划4个平皿，以便收集较多的生长旺盛的典型单菌落，进行保存和鉴定。鉴定时作革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及形态特征。必要时再做生化实验以进一步鉴定该菌种。若在该平板上发现有其它菌落生长，则说明操作有污染或菌种不纯，应将此被污染了的培养物灭活处理，并寻找原因。应根据其原因采取措施重新分离挑选纯菌落。2.4.1.2.22.4.1.2.3培养条件》（附件22.4.1.3第4页共7页2.4.1.3.1，称第1代（G1），复壮后转接至平板上，并在适当温度下培养适当时间，分离单个纯种菌落，此为第2代（G2）。2.4.1.3.2菌种（G2）也称传代用菌种，同时挑取纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作用菌种，此为第3代（W3）。2.4.1.3.32代（G2）菌种管冷冻保存，将工作用菌（W3）于适当温度下培养适当时间后用于日常检验。2.4.1.3.42代（G2）菌种转种于平板和斜面培养基上，平板上的菌种制成冷冻保存管第3代（G3）；斜面培养基的菌种经适当温度下培养适当时间后用作工作用菌种，此仍为第3代（W3）。2.4.1.3.53代菌种（G3）冷冻或低温保存，将生长、转种后的第2代（G2）菌种经高温灭活处理后丢弃。2.4.1.3.6G4转为W5为止，需重新开启冷冻干燥菌种，重复上述规程操作，保存和使用菌种。2.4.1.3.75时，在规定保存期限内，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。2.4.2当无标准用菌种时，可从省（市但应划线接种确认。将购回无异常的传代用菌种（一般为第3代），根据日常检验工作的需要量，挑取纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作用菌种(为第4代)挑取纯菌落制成浓菌悬液按“2.3.2”的方法制备甘油冷冻管或液体石蜡管数支，作为传代用菌种，仍为第32.4.3当工作用菌种代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。取在冰箱4-8℃保存的工作用菌种用普通琼脂斜面传代，将新传代的培养物替代原有的菌种，作为工作用菌种。工作用菌种。第5页共7页细菌每1个月传代一次，霉菌和酵母菌每2个月传代一次，芽胞每3个月传代一次。当超过5代，须用传代用菌种传代。2.4.4有效的预防措施进行自我保护，如工作时必须穿工作服，佩带无菌手套，实验完成以后消毒实验进行的区域、实验仪器和器具。如发生意外，如菌种泄漏或人员受伤，微生物学检验人员应立即向QC主管报告以便及时进行处理。2.4.5包括：名称、编号、代数、传代日期、操作人、有效期。交QC主管统一保管，同时及时填写《菌种传代与保存记录》附表22.5—菌种代码—代次—顺序号—DC、金黄色葡萄球菌—JH、枯草芽孢杆菌—KC、白色念珠菌—BN、黑曲霉菌—HQ、乙型副伤寒沙门菌—SH传代用菌种用G表示,工作用菌种用W表示。传代日期用6位数字表示，年份取最后两位数，月、日分别用两位数。如2015年1月12日传代的第一支大肠埃希菌作为传代用菌种的编号为G150112-DC-3-01。2.62.6.1检定菌种设专人加双锁保管，并对所保存的菌种建立《检定菌种保存、领用登记台账》(附表3)。2.6.2在菌种的保存期间,应每天检查保存菌种冰箱的温度，每周检查菌种管的塞子是否松动或生霉,并及时填写《检定菌种观察记录》如有异常应及时处理。2.6.3,不能随意转让其他单位和个人,需要时应有单位证明和批准手续方可供应。2.72.7.1,需到QC主管领取工作用菌种或传代用菌种,同时填写《菌种发放使用记录》相关内容，以便追踪菌种使用历史。2.7.2菌液的制备：将新鲜的斜面菌种培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌落数10-100cfu的均菌悬液，用于阳性对照试验。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用;若保存在2-8℃，可在24小时内使用。第6页共7页2.8（废弃）的销毁2.8.1下列情况的菌种或培养物或被污染的器具等，必须采用121℃、30分钟湿热灭活处理a.新一代菌种制备成功后的上一代菌种b.超过有效期的菌种c.凡被污染、变异、可疑等异常情况菌种d.其他应废弃的菌种。备注：使用完后的菌种和带有标准菌种的器具和培养物必须采用121℃、45分钟湿热灭活处理2.8.2菌种的销毁由微生物检验员提出申请，交QC主管批准后，由微生物学检验员进行灭活处理，并有其他人在场监督，3.记录归档本标准涉及的记录由质量管理部保存，保存期5年。附件1附件2复活、划线用培养基、培养条件》附表1附表2、保存记录》附表3《检定菌种观察记录》附表4发放记录》附表5《菌种销毁记录》4.变更记载及原因修订号执行日期变更原因、依据及详细变更内容。002010.10.25新订。012012.10.03增加变更记载项。022015.12.31《中国药典》2015年版实施。032017.03.03公司统一修订GMP文件。第7页共7页附件1存温度、保存期限菌种名称保存方法保存温度保存期限大肠埃希菌CMCC(B)44102甘油冷冻管-30℃一年金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003甘油冷冻管-30℃一年乙型副伤寒沙门菌CMCC(B)50094甘油冷冻管-30℃一年枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501液体石蜡管2-8℃一年白色念珠菌CMCC(F)98001液体石蜡管2-8℃一年黑曲霉菌CMCC(F)98003液体石蜡管2-8℃一年附件2、划线用培养基、培养条件菌种名称复活培养基划线用培养基培养温度培养时间大肠埃希菌TSBTSA34℃24小时金黄色葡萄球菌乙型副伤寒沙门菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌TSBSDA或玫瑰红钠琼脂培养基25℃48小时黑曲霉菌7天