病理组织切片技术

组织制片技术病理组织制片技术定义•要实现对病变组织的显微镜形态学检查，需要将获得的病变组织制片。我们将切片制作所采用的一系列技术。组织制作基础制作流程•封片•染色•烤片•贴片•展片•切片•包埋•浸蜡•透明•脱水•洗涤•固定•取材一、取材定义•按照病理检查的目的和要求，切取适当大小和数量的组织块，用于制作组织切片的过程。切片刀取材要求(1)材料新鲜：取材组织愈新鲜愈好，人体组织一般在离体后，动物组织在处死后迅速固定，以保证原有的形态学结构。(2)组织块的大小：所取组织块较理想的体积为2.0cm×2.0cm×0.3cm，以使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部，但根据制片材料和目的不同，组织块的较理想体积也不同，如制作病理外检、科研切片，其组织块可以薄取0.1～0.2cm即可，这样可以缩短固定脱水透明的时间，若制作教学切片厚取0.3～0.5cm，这样可以同一蜡块制作出较多的教学切片。(3)勿挤压组织块:切取组织块用的刀剪要锋利，切割时不可来回锉动。夹取组织时切勿过紧，以免因挤压而使组织、细胞变形。4)规范取材部位:要准确地按解剖部位取材，病理标本取材按照各病变部位、性质的不同，根据要求规范化取材。(5)选好组织块的切面:根据各器官的组织结构，决定其切面的走向。纵切或横切往往是显示组织形态结构的关键，如长管状器官以横切为好。(6)保持材料的清洁:组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等，可用水冲洗干净后再放入固定液中。(7)保持组织的原有形态:新鲜组织固定后，或多或少会产生收缩现象，有时甚至完全变形。为此可将组织展平，以尽可能维持原形。二、固定定义将组织浸入某些化学试剂。使组织细胞内所含物质尽量保持在生活状态时形态结构和位置的过程。固定目的¤防止自溶和腐败¤凝固或沉淀细胞内物质¤硬化组织¤增加组织的折光率固定方法•(1)小块组织固定法：这是最常用的方法，从人体或动物体取下的小块组织，须立即置入液态固定剂中进行固定，通常，标本与固定液的比例为1:4～20，但组织块不宜过大过厚，否则固定液不能迅速渗透。故取组织块的大小一般为2.0cm×2.0cm×0.3cm。•(2)注射、灌注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部，或需要对整个脏器或整个动物体进行固定。这时宜采用注射固定或灌注固定法。将固定液注入血管，经血管分支到达整个组织和全身，从而得到充分的固定。•(3)蒸汽固定法：比较小而厚的标本，可采用锇酸或甲醛蒸汽固定法。如血液涂片，则应在血片未干燥前采用锇酸或甲醛蒸汽接触固定。常用固定液特性渗透力强，能迅速渗入组织内部不会使组织过度收缩或膨胀能硬化、固定组织，使细胞成分的形态和位置与生活状态时相似。使组织对染料产生较强的亲和力，并产生较佳的折光率。常用的固定液单纯固定液①10%甲醛（福尔马林）：甲醛浓度为40%，指10ml甲醛加入90ml的水配成的。②乙醇（80%~90%最好）乙酸（醋酸、冰醋酸）红色字体为常用固定液固定液①中性甲醇液：甲醛120ml，蒸馏水880ml，磷酸二氢钠4g，磷酸氢二钠13g配制而成，PH值达到７。此固定液是人体组织和动物组织常用之固定液，特别是作免疫组织化学染色固定时效果较好。②乙醇-醋酸-甲醇液③乙醇-甲醇液（AF液）：95%或无水乙醇90ml，40%甲醛10ml配制而成④Bouin液⑤Zenker液混合固定液红色字体为常用固定液固定的注意事项♦及时固定（夏天超过4h，冬天超过24h组织会干涸、自溶、腐败。）♦固定容器宜大♦固定液应足量（为被固定组织体积的10~20倍）♦防止组织变形♦确定恰当的固定时间（12~24h）固定液组织固定的常见问题固定液使用时间较长，有效浓度降低固定时间正常，但固定时间效果差固定液的量不足标本过薄标本扭曲变形，过脆过硬固定液浓度过高，过程过强固定时间长标本之间重叠或与容器壁、底部紧贴标本局部固定不良标本过多，容器太少标本轻，漂浮于固定液面标本过大，过厚标本中心固定不透固定液渗透力强，浓度高使组织表层迅速硬化固定时间短固定液失效固定不充分固定充分三、洗涤、脱水、透明洗涤定义用水或乙醇等组织经过固定处理后，未与组织结合的固定液及沉淀物清洗掉的过程。洗涤目的去掉未与组织结合的固定液及沉淀物避免组织中留有较多的固定液而妨碍脱水组织中生成的沉淀物或结晶而影响染色和观察可减少甲醛色素洗涤的方法①含水固定液的洗涤方法（常用的是甲醛，用自来水冲洗即可）②含乙醇固定液的洗涤方法（用乙醇或乙醇混合液固定的组织，一般不需要清洗）③特殊固定液的洗涤方法（使用的固定液不同，洗涤的方法也不一样）脱水定义标本经过固定和冲洗后，组织中含有较多的水分，必须将组织块内的水分置换出来，这一过程。•无论是用石蜡切片，还是用火棉胶切片，都必须除去组织中所含水分，因含水组织与石蜡、火棉胶等包埋材料不相容，常用的脱水剂为一系列不同浓度的乙醇。及时的进行核对脱水目的组织块经巩固定和水洗后，含有大量水分，而水与苯、二甲苯等透明剂不混溶,故在组织前必须用能与透明剂相混合的脱水剂(如乙醇等),把组织内的水分置出来,为下一步做准备。常用的脱水剂①乙醇（最常用的脱水剂）沸点78.4℃，脱水能力强，能硬化组织，可较好地与二甲苯混合。脱水的步骤是：80%、90%、95%、100%各种浓度乙醇2小时，此过程可用脱水机自控完成。柔嫩组织的脱水应从50%或30%乙醇开始组织在高浓度乙醇（无水乙醇）中留置时间不宜过长。②丙酮沸点56℃，可用于染色前后的脱水，对组织的脱水作用，收缩作用均比乙醇强，价格较高，一般很少单纯使用。•丙酮也是一种脱水能力很强的脱水剂，但因其脱水能力很强，对组织有剧烈收缩作用，在制作科研、教学切片时一般不用该试剂。因乙醇、丙酮等不溶于石蜡，还要经过一个能溶于石蜡的溶剂替代过程称为透明。常用的透明剂有二甲苯、三氯甲烷、水杨酸甲酯等③异丙醇是乙醇的良好的代用品，不含水，可代替无水乙醇。脱水的方法自低到高溶度依次进行，使组织中所含水分逐渐减少直至被脱水剂代替。脱水机透明定义用某些化学试剂将组织中的脱水剂置换出来，以利于浸蜡和包埋，因组织块浸入这此试剂后常呈半透明状透明目的Ö透明是制片过程中很重要的环节。大多数脱水剂不能和包埋剂（如石蜡）混溶，而透明剂即可与脱水剂混溶，又能和包埋剂（如石蜡）混溶，能起到桥梁作用。常用的透明剂۩苯۩甲苯۩二甲苯（最常用的透明剂）۩三氯甲烷۩汽油۩香柏油۩冬青油۩松油醇常用的透明方法•将脱水后的组织块先用乙醇-二甲苯混合液处理或直接浸入透明剂中，置换透明剂2~3次即能达到目的。•透明的时间的长短取决于标本的种类和组织块的厚薄，一般活检标本透明15~20min即可。四、浸蜡、包埋浸蜡定义经过透明的组织块在溶化的石蜡中浸渍，使组织中的透明剂被完全置换出来的过程浸蜡的目的•使石蜡浸入组织中，取代组织中含有的透明剂。浸蜡的种类•石蜡•明胶•火棉胶•树脂•碳蜡又是包埋剂。既是透明剂，浸蜡的方法•熔点：56~58℃•温度：58~60℃（高于石蜡熔点2~3℃）浸蜡的注意事项首先，应保证所用石蜡的质量，尽量不含杂质，否则易造成切片刀刀口受损或切片破碎、划痕增多。其次，浸蜡用的石蜡熔点应控制在55~58℃。蜡温过低，浸蜡不良；蜡温过高回烫伤组织，是组织收缩、变硬、切片时易脱片、卷片。再次，要控制好浸蜡时间。时间过短，蜡没有完全渗入组织、组织过软；时间过长，造成组织硬脆。两者均可造成切片困难。另外，应尽量去除沾在组织上的二甲苯，在浸蜡。浸蜡机包埋定义•将浸蜡后的组织置于融化的固体石蜡中，石蜡凝固后，组织即被包在其中称蜡块，此过程称为包埋。包埋的目的♥有利于组织块的妥善保存♥有利于切成薄片♥可使组织具有一定硬度和韧性包埋方法•石蜡包埋法（最常用）•火棉胶包埋法•碳蜡包埋法•明胶包埋法包埋的注意事项包埋时，框要比组织块大，保证蜡块组织周围都有蜡边，对管、腔、壁组织要垂直包埋，而胃、肠、胆囊等组织，应将能看到的组织学各层面作为切面，其他组织则将切面朝下，小块多颗组织尽量放在一起并保持在同一水平面；包埋的蜡质不能含有杂质、纸絮、缝线等异物，最好是经过多次溶化、沉淀过的蜡。以利于切片。包埋机组织包埋盒四、切片常用的切片方法①石蜡切片②冰冻切片③火棉胶切片切片前准备(1)修整蜡块可视其组织的大小，在组织边缘约0.1～0.2cm处，切去余蜡部分。否则易造成组织皱缩不平。(2)准备好切片用具切片刀毛笔眼科镊子（弯）漂烘温控仪(3)安装蜡块将修好的蜡块安装在金属或木制持蜡器上(4)安装切片刀将切片刀安装在切片机的刀台上，把刀台上的紧固螺丝旋紧，使切片时不产生振动，能保持一定的切片厚度组织切片刀(5)切片的厚度切片机的厚度调节器上刻有0～50μm或0～25μm，可任意选择其厚度，石蜡切片的厚度一般在4～6μm切片制作过程1.将切片刀安装于刀架上（调整好刀的角度，一般为20~30°左右）2.将蜡块固定在切片组织块夹具上3.调整组织块夹具的调节蜡旋，使蜡块切面与刀口平行。4.先粗修（30～50um）5.细修（10um）切片的注意事项①切片前蜡块要冷冻，但不能把刚包埋好的热蜡块冷冻，否则蜡块会产生裂痕，一夹就碎。②蜡块装机时，应注意组织包埋的方向，组织的层次、纤维、肌肉等走向应与切片刀平行。③蜡块在切片机固定加紧后要修块，组织块上下留边各2mm④蜡片厚度一般在3-5um⑤同一把切片刀每次要固定角度⑥切片有纵纹,可能与切片刀有小缺口或修块时未把杂物去除,以及石蜡不洁有关切片机五、展片展片定义连续转动旋转轮，切片的蜡片相连成状，需要将其展平整才能贴在载玻片上，此过程为展片。展片捞片展片困难时，可先将蜡带放入30%乙醇处展，在用载玻片捞起蜡带放入温水中。待蜡带中的组织完全展平后，即可将其捞出，称为捞片。捞片六、贴片、烤片贴片、烘片待切片在恒温水面上充分展平后，将蜡片捞到载玻片的中段处倾去载玻片上的余水，置入60～65℃恒温箱内或切片漂烘温控仪的烘箱内烤片15～30分钟，脱去溶化组织间隙的石蜡。烤片机七、染色染色定义用染液对组织切片进行处理，使组织中的不同成分被染上相应的颜色，产生不同的折射率，以利于显微镜观察和分析的方法。常用的染色方法苏木素-伊红（Hematoxylin-Eosin）染色法简称H.E染色法。这种方法对任何固定液固定的组织和应用各种包埋法的切片均可使用。•苏木素是一种碱性染料,可使组织中的嗜碱性物质染成蓝色，如细胞核中的染色质等；伊红是一种酸性染料，可使组织中的嗜酸性物质染成红色，如多数细胞的胞质、核仁等在H.E染色的切片中均呈红色。H.E染色程序如下•脱蜡•脱苯•复水•染色•脱水•透明•封固切片脱水透明要彻底•ＨＥ染色后，要彻底脱水透明，才能进行树胶封盖，成为永久标本。如果脱水透明不彻底，封片后呈白色雾状，镜下模糊不清，过一段时间染片就褪色。脱水要经过多次无水乙醇，也可使用石炭酸二甲苯进行脱水。如采用后者，染片要经过多次二甲苯以除去石炭酸。注意•切片在染色前必须脱蜡干净：未完全脱蜡的组织切片，染色后组织和细胞模糊不清。脱蜡要用两级或三级脱蜡剂如二甲苯，时间为10~20分钟，应视所用二甲苯的新旧以及室温情况而定。脱蜡时间宁可长些，不应过短一张高质量的HE切片要求1.切片完整、贴片恰当2.切片较薄而均匀3.无皱折4.无刀痕5.染色清晰、核浆分明、透明度好6.无固缩、龟裂、污染7.封胶适当、玻片清洁8.字体端正、号码清楚•切片完全干涸，会使组织收缩、割裂，形成所谓”龟裂”现象。也会使部分细胞核透明不良，看起来像黑色的细胞核。•完成染色后，每张片子要在显微镜下观察，检查制片过程中有没有发生差错。八、封片封片注意事项1.所用树胶浓度要适中2.树胶用量多少应根据组织大小、厚薄而定3.应迅速敏捷滴胶4.封片时，切片上应保留适当的二甲苯，以防干封，产生气泡。5.为防止气泡，封片时，树胶不宜搅动。6.如遇有小泡时可用镊子轻压盖玻片，排除气泡。谢谢！