高效毛细管电泳及其应用

高效毛细管电泳及其应用侯晓蓉2020/11/231色谱分析正式进入毛细管电泳方法之前，希望先了解一下“色谱分析”的概念。仪器装置毛细管电泳2020/11/232色谱分析ChromatographyAnalysis色谱法是一种分离技术，该技术应用于分析化学，就是色谱分析。常用来进行混合物中各组分分离与分析的一种物理化学分析方法。色谱法是俄国生物学家茨维特与1906年首先提出的。在研究植物叶片的色素成分时，将植物叶片萃取液倒入装有碳酸钙的玻璃管中，然后用石油醚使其自由流下，随着不断淋洗，结果各组分在柱子上相互分离分开，并形成不同颜色的“色带”，故称为“色谱法。实验中的玻璃柱称为色谱柱，碳酸钙称为固定相，石油醚称为流动相。现今，“色谱”这一名词仍沿用下来。但随着技术的发展，色谱法研究的对象已不局限于有色物质。2020/11/233分离原理：混合物中各组分在两相间进行分配，一相是不动的，称为固定相；另一相是携带混合物流过固定相的流体，称为流动相。由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相发生作用的大小、强度有差异，因此在同一推动力作用下，不同组分在固定相中滞留的时间不同，从而按先后次序从固定相中流出。这种借在两相间分配原理不同而使混合物中各组分分离的技术，称为色谱分离技术或色谱法。色谱法亦称色层法或层析法。色谱法的原理2020/11/234色谱法有多种类型，从不同角度出发，有各种分类法。（1）按流动相物态分为：气相色谱和液相色谱。（2）按固定相形式分为：柱色谱、纸色谱、薄层色谱等。（3）按分离原理机制分为：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、排阻(凝胶)色谱等。色谱方法的分类2020/11/235色谱法的优点分离效率高灵敏度高应用范围广样品用量少分离测定一次完成分析速度快易于自动化2020/11/236色谱仪分类液相色谱仪气相色谱仪分析用色谱仪制备用色谱仪流程色谱仪液液色谱仪液固色谱仪气液色谱仪气固色谱仪排阻色谱仪平面色谱仪离子色谱仪电色谱仪超临界液体色谱仪2020/11/237色谱的定性分析定性分析就是要确定色谱图中色谱峰代表什么物质。定性分析主要依据特征性不是很强的保留值，即相同的物质在相同的色谱条件下应该有相同的保留值。但相反的结论却不一定成立，即在相同的色谱条件下，具有相同保留值的物质不一定是同一物质。1.利用已知物直接对照进行定性分析将未知物与已知标准物在同一根色谱柱上，相同的色谱条件下进行分析，利用保留时间来定性，保留时间相同的两个峰可能代表同一物质。2.利用文献值对照进行定性分析在知道被测未知物属于哪一类化合物后，在文献上给出的色谱条件下分析未知物，并计算它的保留指数，与文献中给出的保留指数进行对照，得到未知物的定性分析结果。2020/11/2383.利用保留值规律进行定性分析4.化学反应定性将色谱法和化学反应结合起来，是一种简便有效的定性方法，特别适合于官能团定性。通常用特征试剂与样品组分进行反应，生成相应的衍生物，则处理后的样品色谱图上该类物质的色谱峰或提前、或后移、或消失。比较处理前后样品的色谱图就可以认为那些组分属于哪类（族）化合物。5.其他定性方法：可利用选择性检验器，色谱与质谱，红外光谱联用等方法定性。2020/11/239色谱的定量分析常用的定量方法有归一化法、内标法和外标法。（1）归一化法(Normalizationmethod)归一化法的适用条件是：样品中所有组分都需流出色谱柱，且在检测器上都有响应信号。（2）内标法（InternalStandardMethod）不要求样品所有组分全部流出色谱柱和都被检测。适用于只需测定混合物中某几个组分，或样品中某些组分无信号或不能分离。准确称取一定量内标物加入样品中，根据被测样品和内标物的质量及其在色谱图上相应的峰面积比，可求出组分含量。（3）外标法（ExternalStandardMethod）又称标准曲线法。将含有已知质量的不同浓度的各种纯样品配成不同含量的标准样，以相同的体积进样，绘制对应的峰面积（或峰高）与质量百分含量标准曲线，然后在相同色谱条件下进等体积的样品，从标准曲线上查出要测组分的含量。2020/11/2310色谱柱质量评价色谱分析的首要任务是分离。分离在色谱柱中进行，因此色谱柱的质量评价是非常重要的。（1）柱效(ColumnEfficiency)通常用塔板理论导出的理论塔板数（n）和理论塔板高度（h）作为衡量色谱柱分离效率的指标（2）选择性因子（SelectivityFactor，α）α为相邻两组分调整保留值之比，α值大，色谱柱选择性好，有利于相应组分的分离。（3）分离度（Resolutionthreshold，R）柱效高和选择性好有利于分离，但都未能反映性质相近两种物质的分离结果，因此引进分离度这一指标。R值越大，分离越好。当R=1.5时，两色谱峰完全分离；R=1时，分离可达98%。2020/11/2311毛细管电泳CapillaryElectrophoresis在外加电场的影响下，带电的胶粒或离子向电性相反方向迁移的现象称为电泳。利用该现象进行分离分析的技术称为电泳技术。混合物中不同带电粒子由于荷电量不同，分子大小不同，泳动速度也就不同，因此，电泳是一种适合于带电胶粒和离子的分析分离技术。毛细管电泳是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据试样中跟组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离、分析物质的一类液相技术。2020/11/2312一、高效毛细管电泳技术概述二、高效毛细管电泳仪器流程和主要部件三、高效毛细管电泳理论基础四、高效毛细管电泳分离模式五、高效毛细管电泳应用2020/11/2313毛细管电泳是电泳的一种，毛细管电泳的发展要从电泳的产生、发展讲起，大约经历了如下几个阶段：（1）1809年，俄国物理学家Pence首次发现电泳现象（2）瑞典科学家Tiselius在1937年提出将电泳作为分离技术，创造了Tiselius电泳仪，并建立了移动界面电泳方法，分离了5种蛋白，1948年获得诺贝尔化学奖。（3）1959年，Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持电解质，创造了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了区带电泳的分辨率。毛细管电泳简单历史2020/11/2314（4）20世纪60年代，Svernsson、Vesterberg、Martin、Everaerts、Konst-antinov、Oshurkova和Ornstein等的工作，促进了等速电泳的产生和发展（5）1967年Hjerten首先报道了开管毛细管电泳，后来Virtanen和Mikkers先后分别在约200m内径的玻璃或Teflon毛细管中进行电泳，这些是毛细管电泳的最初期工作。（6）1981年，Jorgenson和Lukacs使用75m内径100cm的玻璃毛细管在30kV的高电压下进行电泳，获得了数十万理论塔板数的高分离效率，使毛细管电泳技术有了突破性进展。2020/11/2315（7）1984年，Terabe发展了毛细管电泳的新分支-毛细管胶束电动色谱(MEKC)（8）1987年,Hjerten提出了毛细管等电聚焦(CIEF)。同年，Cohen和Karger发表了毛细管凝胶(CGE)的研究工作。到此为止，毛细管电泳所有传统分离模式全部诞生，标志着毛细管电泳技术的发展成熟。图3常用几种型号的高效毛细管电泳仪2020/11/23161、高效毛细管电泳技术简介毛细管电泳(capillaryelectrophoresis)又称高效毛细管电泳(high-performancecapillaryelectrophoresis,HPCE)，是20世纪80年代中期问世的一种高效液相分离法，是经典电泳技术与现代微柱分离相结合的产物。是离子或荷电粒子以电场为驱动力,在毛细管中按其淌度或/和分配系数不同进行高效、快速分离的一种电泳新技术。2、高效毛细管电泳技术基本原理最基本的高效毛细管电泳仪器如图1所示：高效毛细管电泳（HighPerformanceCapillaryElectrophoresis）技术概述2020/11/2317毛细管电泳仪基本结构+-高压电源毛细管检测器放大器模数转换工作站缓冲液池电极2020/11/2318样品在毛细管中的分离过程如图2所示：分离过程：电渗流：电场作用下，毛细管柱中出现：电泳现象和电渗流现象图2毛细管电泳分离示意图2020/11/2319带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反。ν电渗流ν电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。2020/11/2320由于毛细管具有良好的散热效能，允许在窄内径毛细管两端加上高达30kV的高电压，分离毛细管的纵向电场强度可达400V/cm以上，可以在很短的时间内达到很高的分离效率，具有以下特点：（1）分离速度快（高压、高电场强度）在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分离了24种阳离子（2）分离效率高（N105~106）（3）运行成本低毛细管电泳的特点2020/11/2321（4）样品与试剂消耗量少（1~50nL）（5）可供选择的分离模式多，应用范围广（6）分离一般在水溶液介质中进行（7）方法简单，仪器自动化程度高（8）环境污染小2020/11/2322高效毛细管电泳普通色谱2020/11/2323高效毛细管电泳普通色谱2020/11/2324表1高效毛细管电泳与高效液相色谱性能比较2020/11/2325•电压：0～30kV；•分离柱不涂敷任何固定液；•紫外或激光诱导荧光检测器；（可检测到：10-19～10-21mol/L）图4高效毛细管电泳流程图图5高效毛细管电泳基本装置二、高效毛细管电泳仪器流程和主要部件（processandmainassemblyofhighperformancecapillaryelectrophoresis)2020/11/23261.高压电源（1）0～30kV稳定、连续可调的直流电源；（2）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3）电场强度程序控制系统；（4）电压稳定性：0.1%；（5）电源极性易转换；2.毛细管柱（1）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性能差；（2）规格：内径20～75μm，外径350～400μm；长度=1m2020/11/23273.缓冲液池化学惰性，机械稳定性好4.检测器要求：具有极高灵敏度，可柱端检测；检测器、数据采集与计算机数据处理一体化；2020/11/2328类型检测限/mol特点紫外-可见10-13～10-15加二极管阵列，光谱信息荧光10-15～10-17灵敏度高，样品需衍生激光诱导荧光10-18～10-20灵敏度极高，样品需衍生电导10-18～10-19离子灵敏，需专用的装置表2各种类型检测器性能列表2020/11/23295、高效毛细管电泳进样方式（InjectionMethodofHPCE）进样量：毛细管长度的1%~2%；纳升级、非常小(1)流体力学进样方式a、进样端加压b、出口端抽真空c、虹吸进样2020/11/2330（2）电动进样方式毛细管一端插入样品瓶，加电压；特点：进样不均：电歧视现象，淌度大的离子比淌度小的进样量大；离子丢失：淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进不去；特别适合黏度大的试样（3）扩散进样试样通过扩散作用进入分离柱端口处2020/11/2331（一）高效毛细管电泳(HPCE)基本原理（basicprinciplesofHPCE）电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度，当带电离子以速度ν在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。电场力：FE=qE阻力：F=fν故：qE=fνq—离子所带的有效电荷；E—电场强度；ν—离子在电场中的迁移速度f—平动摩擦系数(对于球形离子：f=6πηγ；γ—离子的表