免疫组化实验方法

免疫组化实验方法免疫组织化学的概念利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。2最突出的优点•在更广阔的范围内，把结构与功能及代谢结合起来，在微观世界原位地确定组织及细胞结构的化学成分，达到方法统一，定性可靠，定位准确，定量可能。3免疫组化实验标本•组织标本（石蜡切片和冰冻切片）•细胞标本（组织印片、细胞爬片和细胞涂片）。•石蜡切片对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档；4细胞和组织的固定1．固定的作用--使细胞内蛋白质凝固、终止或抑制外源性和内源性酶活性，最大限度地保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。2．选择最佳固定液的标准：保持组织形态结构；保存抗原性。（1）醛类固定剂：穿透性较强，收缩性小，是常用的固定剂。如10％中性福尔马林液、4％多聚甲醛缓冲液、戊二醛-甲醛液、乙酸-甲醛液等。（2）非醛类固定剂：适用于多肽类激素的组织固定，常与戊二醛或多聚甲醛混合使用。（3）丙酸及醇类固定剂：沉淀蛋白质和糖，保存抗原性较好。但对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质的保存效果较差，和其它试剂混合使用加以解决，如加冰乙酸、乙醚、氯仿、甲醛等。3．常用的固定方法--浸入法和灌注法（适用于动物实验研究）组织新鲜勿干燥体积适中固定液足够（20倍）5抗体常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。特性比较：1.均一性2.稳定性3.特异性4.重复性5.沉淀反应6荧光素标记抗体能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光色素。必备条件:③荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。④结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响，用于活体内标记，结合物应无毒，附加抗原性小。7常用的染色方法•根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法•按标记物定位于抗原所在部位的手段，则可将免疫细胞组织化学染色方法分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥连法等。每进行一步结合反应。都会产生一次阳性结果的放大效应。敏感性由高到低依次为桥连法、间接法、直接法。8染色的基本程序①标记抗体与标本中抗原反应结合；②用缓冲液洗去未结合的成分；③直接观察结果；或显色后再用显微镜观察。9反应条件抗原抗体结合属于可逆性反应，具有共性的反应条件：（1）PH：中性及弱硷性条件（PH7～8）有利于免疫复合物的形成（2）离子强度：0.01～0.02M的低离于强度有利于免疫复合物的形成（3）去污剂：有利于复合物的形成，常用的非离子型去污剂有吐温-20，EDTA（0.01%），TritonX-100（0.1～1%）（4）抗体稀释液中蛋白质浓度：稀释液中含无关蛋白质可以减少抗体的非特异吸附，常用牛血清白蛋白（5）防腐剂：微生物生长会干扰抗原抗体反应，稀释液和抗体液中加入适量的叠氮钠或硫柳汞以防腐（6）温度和时间：较高的反应温度（37℃）可加速抗原抗体结合反应，低温有利于抗原抗体结合率的提高（7）洗涤：除去未结合抗原或抗体，除去非特异性吸附造成的背景染色。选用自来水、生理盐水或PBS等，加去污剂并在洗涤过程中加以振摇10荧光素1，异硫氰酸荧光黄（fluoresceinisothiocyanate，FITC）黄色、橙黄色或褐黄色结晶粉末，最大吸收光谱为490～495nm，最大发射光谱为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。最常用。2．四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyante，TRITC）紫红色粉未，较稳定，最大吸收光谱550nm，最大发射光谱620nm，呈橙红色荧光，与FITC发射的黄绿色荧光对比鲜明。3．四乙基罗丹明（tetraethylrhodamineB200，RB200）褐红色粉未，最大吸收光谱570nm，最大发射光谱596～600nm，呈橙红色荧光。价廉。11染色注意事项（1）在湿盒内进行，以免标本上的试剂干燥。（2）酸碱度以接近体液环境为宜（PH7.4左右）（3）组织细胞要求新鲜，最好使用冷冻切片，固定存档标本要求组织结构完好。（4）切片经染色后，应及时观察并照相。切片在4℃冰箱内过夜，其荧光强度将减弱约30％。（5）调整抗体稀释度以获得最佳染色效果，以背景非特异性染色最小为标准，对每一批抗体必须试验摸索，找出最佳稀释度。（6）所购抗体应及早使用，尽量减少抗体溶液的冻融次数。12酶标抗体法•通过共价键将酶结合在抗体上制成酶标抗体，再借酶对底物的特异性催化作用，生成有色的不溶性产物，于显微镜下进行细胞或组织表面或内部某种抗原成分定位观察。•常用的酶--辣根过氧化物酶（HRP），碱性磷酸酶（ALP）及葡萄糖氧化酶（GOD）等。•优点：与免疫荧光技术相比，终产物可在普通光镜下观察，切片能够长久保存，经锇酸处理后，电子密度增强，可用于电镜观察。13抗生物素-生物素-过氧化物酶技术(avidin-biotinperoxidasecomplexABC)•原理：利用抗生物素分别连接生物素标记的第2抗体和生物素标记的酶。其第1抗体不为标记物所标记，生物素标记的第2抗体与ABC复合物相连接。ABC复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将生物素-过氧化物酶连接物与过量的抗生物素蛋白反应而制备的。常用：•ABC-HRP辣根过氧化物酶：最通用的系统，使用范围广•ABC-AP碱性磷酸酶：灵敏度比较高，染色密度较低•ABC-GO葡萄糖氧化酶：灵敏度较低，适用于组织内源性HRP或者AP含量比较高的组织，常与HRP或者AP系统配合进行双染141516ABC法的特点：•敏感性强•特异性强，背景染色淡•方法简便，节约时间•可用于双重或多重免疫染色。17免疫金染色原理：免疫金染色技术使用胶体金耦联抗体，然后在光学显微镜下检测抗原。解决了免疫组化里内源性酶干扰的问题。整个检测过程中无需酶的参与，因此不必预先处理样本以消除内源性酶的活性。免疫组化试剂的正确选择和使用18一抗1.首选单克隆抗体：单克隆抗体具有高特异性、高亲和力、交叉反应少等特点，避免与细胞或组织蛋白的非特异性结合，减少染色背景。2.多克隆抗体：最好是经样本来源种属正常血清吸附过，尽可能的减少非特异性着色背景。加一抗前，用封闭液（可以是BSA或二抗来源的正常动物血清）充分封闭，以阻断非特异性结合位点。3.跨膜分子的抗体选择：要注意免疫原是整个蛋白分子或是胞外区、胞内区。对于胞内区抗体，染色时需要使用穿孔剂，而胞外区抗体不必使用。4.正确使用：一般供应商都会提供稀释范围和使用方法。但常常需要重新选择比例。一般从供应商提供稀释比例的1/10稀释度始，作倍比稀释。1920二抗1.种属来源要匹配：根据所用一抗选定二抗。一般来说，如果一抗是小鼠原性，二抗应选择兔/山羊或其它种属抗小鼠的抗体。2.注意抗体同种型和亚型：确定一抗同种型和亚型后，可以选择抗一抗来源种属广谱Ig或针对一抗亚型的二抗。如一抗是小鼠IgG1,可以选用山羊抗小鼠的Ig或IgG1的二抗。3.正确使用：也需要重新选择稀释比例。一般从供应商提供稀释比例的1/10稀释度始，作5倍比稀释。21设立阳性对照和阴性对照----证明实验系统的正确性1.阳性对照：主要涉及所用缓冲液、稀释液、二抗和检测系统等因素。尤其在结果出现无信号时，为查找原因提供重要线索。2.阴性对照：一种是自身对照（常用），指测试组织本身非抗原表达部位。一种是外部对照，指已证实不表达检测抗原的组织。22试剂保存------抗体试剂保存：•抗体浓度越高越稳定，易保存；浓度低时，应加0.1%-1.5%的牛血清白蛋白作保护剂；必要时需要加0.01-0.15％NaN3防腐剂以延长保存时间。•酶标记抗体在应用防腐剂时要注意不能用NaN3，否则会抑制酶的活性。•抗体浓缩液应在-20℃保存，可以长达两年；用时取出，室温融解，如一次或短时间用不完，应进行小量分装，-20℃保存，避免反复冻融；融解后抗体于2－8℃可以保存一个月。