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1生化物质分离纯化基础实验两水相萃取蛋白质的相图及分配系数2PEG/(NH4)2SO4两水相系统的相图生化物质分离纯化基础实验一.实验原理高聚物与无机盐成相的原因:用相图表示两水相形成的条件和定量关系,它是一根双节线(binodal)。无机盐盐析作用。PQ互溶区两相区3二.相图的制作方法(一)溶液配制配制43.00%(g/ml)的(NH4)2SO4溶液:称硫酸胺215.0g少量水溶解稀释至500ml密度计测密度生化物质分离纯化基础实验4PEG400%(NH4)2SO4%按表格重复操作…PEG4000.700gH2O0.5ml(NH4)2SO4混和H2O0.3ml浑浊记录(NH4)2SO4ml数混均(二)相图的制作澄清生化物质分离纯化基础实验5表1.相图制作表次数H2Og(NH4)2SO4溶液加量mlg纯(NH4)2SO4累计量g溶液累计总量gPEG%(g/g)(NH4)2SO4%(g/g)12345670.50.30.30.30.50.50.5(NH4)2SO4溶液浓度43.00%(g/ml)密度1.20g溶液/ml溶液PEG400=______g温度=______℃生化物质分离纯化基础实验6两水相系统中蛋白质分配系数的测定一.实验原理1.糖化酶为生物大分子蛋白,在双水相系统中不同程度地分配,分配系数K=C上/C下。相比R=V上/V下2.考马斯亮兰(CoomassieBrilliantBlueG-250)比色法测定两相中蛋白质浓度:考马斯亮兰G-250是一种染料,酸性溶液中呈棕红色。与蛋白质通过范德华键结合成兰色复合物,595nm波长有最大吸收值。低浓度时,与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。生化物质分离纯化基础实验7二.操作方法(一)蛋白质在两相中的分配:10ml刻度离心试管加(NH4)2SO4固体1.30克加PEG4002.00克加入糖化酶2.00ml加水总重8.00g离心3000转/分5min振摇混和(固体溶解)求相比R=V上/V下求蛋白质分配系数K=C上/C下生化物质分离纯化基础实验8生化物质分离纯化基础实验◆试剂配制1.考马斯亮兰G-250溶液配制:精确称取50mg考马斯亮兰,溶于10ml95%乙醇中,并加入50ml85%浓磷酸,然后,用H2O稀释定容至500ml。2.牛血清蛋白溶液配制:精确称取0.012g左右的牛血清蛋白,加入0.105gNaCl,溶于少量蒸馏水中,然后,稀释定容至100ml,配成120g/ml的牛血清蛋白原液。(二)比色测定上、下相蛋白质浓度:9生化物质分离纯化基础实验牛血清蛋白mlH2Oml0.20.40.60.81.00.80.60.40.2/上相液1.0ml/下相液0.1ml0.9ml加考马斯亮兰5.00ml,混匀,25℃±1℃保温10分钟,冷却蛋白质总重g//OD(595nm)◆标准曲线制作方法:见下表◆上相液:吸取0.5ml蒸馏水定容至50ml按下表操作。下相液:直接按下表操作。空白液:吸取1.0ml蒸馏水+5ml考马斯亮兰液。表1.标准曲线和样品的测定牛血清蛋白浓度120g/ml10mlgKbODC/100上上相标准曲线图:ODμgOD=K·μg+b求斜率K和截距bmlgKbODC/1.01下下相生化物质分离纯化基础实验11生化物质分离纯化基础实验●思考和讨论:二.选择正确的离心操作顺序:1.将装有相等体积的两只离心试管(水和样品液)对称放在离心机中。2.将两只装有液体的离心试管放入套管中一起称重平衡对称放在离心机中。一.加完物料后必须将离心试管沿轴向充分振摇,直至固体全部溶解,原因是什么?三.选择正确的吸出上、下相操作方法:1.吸管小心插入下相,吸出下相换吸管,吸出上相。2.吸管小心吸出上相插入下相,吸出下相。3.吸管小心吸出上相将多余上相和少量下相弃去换吸管,吸出下相。12生化物质分离纯化基础实验四.可调式移液器(枪)正确的操作方法(是非题):1.要吸取0.4ml液体,可用1000~5000μl规格的枪。2.向顺时针方向旋,数值减小;逆时针方向旋,数值增大。3.下列操作哪一个正确:(a)吸液时向下按到第一停点;放液时向下按到第二停点。(b)吸液时向下按到第二停点;放液时也向下按到第二停点。
本文标题:双水相萃取实验
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