制备型高效液相色谱

第十二章制备型高效液相色谱在生物制药中的应用•基因工程药物:白细胞介素、胰岛素。•天然产物:蛋白质,多肽,多糖。第一节高效液相色谱法简介液相色谱的发展史•1903年，色谱法问世俄国植物学家茨维特1903年3月21日，大会报告“一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”1906年在德国植物学杂志发表文章，首次命名上述分离后色带为色谱图，称此方法为色谱法•1931年，库恩（Kuhn）分离胡萝卜素，1938年，Kuhn和Lederer从维生素B中分离出B6，获得了1938年的诺贝尔化学奖。•1941年，马丁（Martin）和辛格（Synge）提出液液分配色谱法，1952年度的诺贝尔奖。•60年代末，70年代初，高效液相色谱仪的成功研制1.2基本仪器装置•输液系统•进样系统•分离系统•检测系统•数据处理系统2.1高效液相色谱仪组成1输液系统(1)高压输液泵作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。高压输液泵在线脱气装置(1)高压输液泵(2)在线脱气装置作用：脱去流动相中的溶解气体。流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。在线脱气、超声脱气、真空脱气等脱气不好时有气泡，导致流动相流速不稳定，造成基线飘移，噪音增加。PressureDampersO2,N2,CO2…（3）梯度洗脱装置Isocraticelution恒定组成的单一溶剂体系Gradientelution以一定速度改变多种溶剂的配比淋洗，目的是分离多组容量因子相差较大的组分High-PressureMixing2进样系统六通阀3色谱柱Normalcolumn5-m、4.6-mNarrowborecolumn1-3mMicrocolumn1m色谱柱是实现分离的核心部件。要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。色谱柱填料sphericalandirregularsilicaparticlesMacroporoussphericalsilicaparticle.[K.K.Unger,Poroussilica,Elsevier,1979]基质：载体或担体。数m~数十m，球形。硅胶或有机高分子聚合物PellicularparticlePorousparticle30-50m1-2m3-10m色谱柱填料功能层：物理吸附或化学键合三、高效液相色谱法的特点•采用高效色谱柱、高压输液设备和高灵敏度检测器,从而实现了高效、高速、高灵敏度和定量准确。•和经典液相相比有以下优点：快速、灵敏度高、分辨率高、自动化程度高等。四、制备型高效液相色谱与分析型高效液相色谱法的区别•流速不同•检测池不同•上样量不同•色谱柱不同五、色谱的基本理论及有关参数两大理论：•塔板理论(theplatemodel):阐明了色谱、蒸馏和萃取之间的相似性，将色谱柱设想成由许多液液萃取单元或理论塔板组成；相似于精馏过程，色谱分离也是一个分配平衡过程.N=16(tR/wb)2N=5.54(tR/w1/2)2•速率理论:研究各种动力学因素对峰展宽的影响。H=A+Cu有关参数•分离度：在色谱过程中表示两组分相互分离的程度,一般情况下,分离度大于1.5时称分离完全.只有峰窄而间距大的分离是令人满意的。在色谱分析中要求：两组分的保留值差别要足够大。两色谱峰要足够窄。待测组分的分离度要足够大，分离过程要尽可能短.2121)(2)(211212WWttWWttRrrrr•容量因子：溶质在固定相中的总摩尔数与流动相中总摩尔数之比。•选择因子：两组分容量因子的比值•容量因子、选择因子、理论塔板数对分离度的影响00tttkR12kk2122)1)(1(41NkkR六、制备型高效液相色谱的重要参数Capacity:纯化过程中，目标物质的上样量。可以是体积也可以是质量。Speed:在除去蛋白酶的过程中此项非常关键。Recovery:产品贵重时此项很重要。流动相的条件、环境会影响它。减少步鄹和保持一种对生物样品合适的环境条件。Resolution:在纯化的最后阶段，此项很关键，尤其是杂质的结构和目的物结构相似时。七、分离机理和色谱类型分离蛋白质类物质时的分离依据：疏水性分子大小等电点结构特异性色谱介质按分离机理分为正相色谱反相色谱：常加入TFA离子交换色谱：阴离子交换色谱（DEAE二乙基氨基乙基，Q季胺盐）阳离子交换色谱（CM羧甲基S磺酸基）凝胶过滤色谱疏水色谱：苯基，辛基等。金属螯合色谱：镍、铜等亲合色谱第二节分离方案的设计•Whatistheintendeduseoftheproduct?•Whatkindofstartingmaterialisavailableandhowshoulditbehandled?•Whatarethepurityissuesinrelationtothesourcematerialandintendeduseofthefinalproduct?•Whathastoberemoved?•Whatmustberemovedcompletely?•Whatwillbethefinalscaleofpuridication?•Whataretheeconomicalconstraintsandwhatresourcesandequipmentareavailable?一、分离方法之间的组合四步纯化法：Preparation:Capture:(Isolate,concentrateandstabilize)Intermediatepurification:(Removebulkimpurities)Polishing:(Achievefinalhighlevelpurity)•色谱之间的组合方案•AC、GF、IEX、HIC二、分离条件的优化合适的溶剂强度:容量因子k’足够的柱效N:良好的分离选择性α:当柱过载时：1N和k’都随样品负荷的增加而迅速地减小2流速对于塔板数N的影响大大地降低3通过增加柱长来有效地提高柱效，不宜通过降低柱压（或流速）来达此目的制备分离的两种途径：第一种，基本上同于分析型，进样量不过载，利用大内径的柱，通过调整分离方程中的有关参数来达到分离的最佳化。在该法中往往利用小颗粒的填料（约10μm）来制取少量价值高而难分离的物质。第二种，使用大粒度填料（～50μm）的大内径柱，在过载情况下制备相对大量的纯物质。当α值相当大时（例如＞1.2），提高洗脱液的流速并不至于严重降低分离度，从而大大缩短分离时间。三、制备型高效液相色谱常见问题及解决办法•待分离成分呈单一主峰•不易分开的两组分•目的组分含量少•待分离成分呈单一主峰•不易分开的两组分•目的组分含量少第三节实验条件的选择•色谱柱的选择与填装•柱填料•流动相选择•检测器的选择•仪器设备一、柱的选择和装填柱：•不锈钢柱：200kg，生物适应性差•玻璃柱：10～15kg•聚合物柱：装填：•当粒度小于20μm，用较大的匀浆罐湿法填装。粒度大于30μm时；利用轻敲柱外壁的干填法二、柱填料•硅胶：•葡聚糖和琼脂糖：•高分子聚合物：•颗粒大小•在α很小的分离制备中，要求较高的N值，宜用小粒度的填装柱。•当α很大时，用大颗粒填装柱，对过载进样是有好处。三、洗脱剂•可利用相同填料的分析柱，选择最适合于分离目的和要求的流动相的组成（如溶剂的配比，离子强度，pH等），将其直接或略加修改后用于制备分离•一般不采用梯度洗脱•选择合适的溶剂溶解样品•采用色谱纯的试剂四、仪器设备•对泵的精密度和准确度要求不高（0.01～100mL/min）•对检测器的高灵敏要求不高•流路系统尽可能用惰性聚合材料•柱外效应试验结果影响较小第四节操作变量的确定一、样品的进样量•宜注射低浓度大体积的样品，不宜注射高浓度小体积的样品。•样品进样的体积与柱的内径、柱长、流动相和固定相的类型、样品的溶解性以及分离目的有关。柱内径，mm困难的分离（α＜1.2），mg容易的分离（α＞1.2），mg20.2～25～25810～50100～50025100～5001000～5000二、制备产率•·产率随分离度的提高而增加。•·不过载的柱子，k’值较小时，产率较高。•·用全孔填料时产率高于用薄壳型的。•·对于α值小的分离，宜利用小粒度（5～10μm）填料的柱子；在α较大时，使用较大颗粒、大内径的柱，将获得较高的产率，且价格便宜。•·柱的样品容量和产率随柱横截面积的增加而增大。•产率随柱长、流动相的流速的增加而增加。三、回收率计算和纯度鉴定•除去组分中的溶剂：热的氮气流吹，真空旋转蒸发，冷冻干燥。•纯度：HPLC，TCL。•回收率：重量，活性。蛇毒中溶栓组分的分离制备型高效液相色谱的应用•肽的分离•蛋白质的分离•多糖的分离•核酸的分离肽的分离：常用方法为反相色谱和离子交换色谱肽的保留时间可用氨基酸的保留常数之和预测。反相色谱分为：缓冲液反相色谱，离子对反相色谱。肽的检测：UV200～230nm，荧光检测。蛋白质的分离1．填料：孔径300～5002．流动相（1）pH低pH使蛋白质羧基解离受到抑制，极性降低，与反相键合相的作用强。对大多蛋白质而言，使用pH2.5～3.5的流动相可以得到最好的分离。（2）离子强度和离子对试剂增加离子强度增加了蛋白质与键合相的疏水作用，较高的离子强度（＞0.2）可使蛋白质有较好的分辨率和回收率。缓冲液中的盐还能通过形成离子对改变蛋白质分子表面极性。反离子是疏水的（如三氟乙酸根、七氟丁酸根），复合离子对保留时间增长。如果反离子是亲水的（如磷酸根、甲酸根），则复合离子对保留时间减少。•（3）有机溶剂•有机溶剂的选择是改变蛋白质保留性的重要手段之一。较常用的有乙腈和丙醇。•使用复合溶剂（如异丙醇-乙醇、乙腈-异丙醇等）可降低有机溶剂总浓度并改善分辨率及回收率。•（4）表面活性剂两性离子表面活性剂可以减少高分子量、疏水性较强的蛋白质的拖尾，使分离得以改善。•（5）温度为了防止蛋白质的不可逆变性和失活，分离一般在室温或低温下进行。三、多糖的分离分离：高效体积排阻色谱检测：常用示差折射仪（RI）示差折射检测器通过连续监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测定溶质浓度。由于折射率是物质的通用性质，示差折射检测器是一种通用型的整体性质检测器凡是与流动相光折射率有差别的样品都可用它来测定，其检测限可达（10-6~10-7）g/mL。由于折射率对温度的变化非常灵敏，大多数溶剂折射率的温度系数越为5×10-4，因此，检测器必须恒温，才能获得精确的结果。折射检测器的灵敏度较低，不能用于梯度洗脱。四、核酸与核苷酸的分离五、脂类的分离